바이오 수소생산을 위한 양돈폐수와 음식물탈리액 혼합물로부터 혐기성 산발효 슬러지의 전처리 영향
Effect of Pretreatment of Anaerobic Acid Fermentation Sludge from Mixed Swine Wastewater and Food Waste Leachate on Biohydrogen Generation
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Abstract
목적
본 연구는 양돈폐수와 음식물 탈리액 혼합액을 기질로 혐기성 소화조의 산발효조 슬러지와 메탄발효 슬러지에 열충격과 2-bromoethanesulfonate (2-BES) 주입에 따른 수소생산성과 메탄생성균의 억제 영향을 파악하고 바이오가스, 휘발성 지방산과 알코올 같은 발효산물, 미생물군집분석 변화를 분석하여 효율적인 혐기성 수소 생산 전처리 조건을 도출하고자 한다.
방법
일정 비율로 주입한 양돈폐수와 음식물 탈리액을 기질로 사용하여 장기간 운영중인 혐기성 소화시설의 산발효조와 메탄발효조 슬러지를 채취 후 실험군인 열충격(90℃, 15분) 가한 반응기와 2-bromoethanesulfonate (1, 5, 10, 50, and 100 mmole/L)를 주입한 반응기, 대조군인 전처리 진행하지 않은 반응기를 30℃에서 회분식 운전하여 바이오가스, 유기물질(COD, VS, VFAs, 알코올 등), 미생물군집 분석을 진행하였다.
결과 및 토의
메탄발효조 슬러지에 열충격 반응과 서로 다른 농도의 2-BES를 주입한 전처리 실험군 및 대조군에 양돈폐수를 기질로 반응을 진행한 결과, 모든 조건에서 수소가스는 생산되지 않았으나 열충격 반응기가 2-BES 주입 반응기 보다 메탄생산을 억제하였다. 2-BES의 농도가 증가할수록 메탄생산량은 감소하였다. 산발효조의 슬러지를 이용하여 같은 조건으로 실험한 결과 모두 Clostridium spp.의 우점에 의한 낙산 생산에 의해 수소가 생산되었지만, 시간에 따른 양상은 달랐다. 2-BES 주입한 실험군에서는 수소생산 이후 1mmol/L의 낮은 2-BES 농도에도 메탄생성균의 억제에 의해 메탄가스가 발생하지 않았다. 하지만 대조군에는 수소 생산 이후 시간이 지나 Methanobrevibacter, Methanosphaera 속과 같은 수소영양성 메탄생성균의 대사에 의해 생산된 수소는 모두 메탄으로 전환 되었다. 열충격 실험군은 수소생산균의 지체기가 길어짐에 따라 다른 반응조건에 비해 수소생산이 늦어지고 12일 이후에 수소영양성 메탄생성균의 대사가 시작된 것을 확인할 수 있었다. 열충격과 2-BES 주입으로 초기보다 산발효 진행 후 박테리아 군집의 다양성이 줄어드는 것을 확인하였다.
결론
양돈폐수와 음식물 탈리액 혼합액을 기질로부터 효율적인 혐기성 수소 생산을 위해서는 산발효조 슬러지에 2-BES 주입이 열충격 방법보다 수소생산효율과 지속적인 메탄생성균 억제 측면에서 적정한 방법이라 파악된다. 향후 현장적용을 위해 후속메탄생산공정을 고려한 보다 더 경제적이며 효율적인 전처리 방법과 운전 방법을 찾는 후속 연구가 필요할 것으로 사료된다.
Trans Abstract
Objectives
This study aims to investigate the effects of heat shock and 2-bromoethanesulfonate (2-BES) injection on hydrogen production and methanogens inhibition in anaerobic acid fermenter sludge and methane fermenter sludge using mixed swine wastewater and food waste leachate as substrates. Additionally, the analysis of biogas, fermentation products such as volatile fatty acids (VFAs) and alcohols, and microbial community changes were conducted to derive efficient pretreatment conditions for anaerobic hydrogen generation.
Methods
Sludge samples were collected from two-phase anaerobic digesters treating swine wastewater and food waste leachate. Heat shock (90°C, 15 min) and 2-BES injection (1, 5, 10, 50, and 100 mmol/L) pretreatments were applied to the each sludge, along with control reactor without pretreatment before anaerobic digestion. Batch experiments were conducted at 30°C to assess biogas, organic compounds (COD, VS, VFAs, and alcohols), and microbial community composition.
Results and Discussion
In methanogenic sludge, hydrogen gas was not produced under all conditions, but heat shock method inhibited methane production more effectively than 2-BES injection method. As the concentration of 2-BES increased, methane production decreased. Conversely, hydrogen was produced from the all acid fermentation sludges, mainly attributed to the butyric acid production by dominant Clostridium spp., but the pattern of biogas production varied over time. In the experimental group injected with 2-BES, even at a low concentration of 1 mmol/L, methane gas did not produce due to the inhibition of methanogens. However, in the control group, produced hydrogen was entirely converted to methane by hydrogenotrophic methanogens such as Methanobrevibacter and Methanosphaera. The heat shock group showed delayed hydrogen production due to prolonged lag phase of hydrogen-producing bacteria, with hydrogenotrophic methanogen metabolism starting after 12 days. Heat shock and 2-BES injection reduced bacterial diversity in the acid fermentation process compared to the initial stage.
Conclusion
For efficient anaerobic hydrogen production from swine wastewater and food waste leachate, 2-BES injection into the acid fermentation sludge was found to be a preferable method over heat shock, considering hydrogen production efficiency and sustained methanogen inhibition. Further research is needed to find more economical and efficient pretreatment methods and operational strategies considering subsequent methane production processes for practical application in the field.
1. 서 론
세계 에너지 수요는 대부분 화석연료에 의존하고 있으며 연소 시 발생되는 이산화탄소는 환경오염 문제들을 야기시킬 뿐만 아니라 화석연료 고갈의 문제로 인해 이를 대체하기 위한 지속 가능하고 청정한 에너지 기술 개발이 요구되고 있다. 이에 신재생에너지의 활용이 가속화될 전망이며, 그 중 수소에너지는 122kJ/g의 단위질량당 높은 에너지 밀도 함유하고 연소 시 온실가스를 배출하지 않는 장점을 지녀 탄소 중립 달성을 위한 청정에너지원으로 주목받고 있다[1].
수소생산방법 중 생물학적 수소생산의 대표적인 공정인 혐기성 수소발효는 매장량의 한계가 있는 화석연료에 의존하지 않고 저가의 다양한 유기성 폐자원을 처리함과 동시에 에너지를 생산할 수 있는 장점을 지녀 긍정적으로 평가되고 있다[2]. 국내의 경우 유기성폐자원 중 가축분뇨의 발생량은 2021년 기준 142,027 톤/일, 음식물 폐기물 발생량은 14,885 톤/일이 발생하여 연간 가축분뇨 23,327,935 TOE 및 음식물 2,173,210 TOE의 높은 에너지 잠재량을 가진다[3,4]. 실증화된 여러 시설에서 바이오가스 생산의 효율적 운영을 위해 가축분뇨와 음폐수를 혼합하여 이상(two-stage) 혐기성 소화 공정의 기질로 이용하고 있다[5]. 이상 공정 중 메탄발효조(2nd stage)를 통한 바이오메탄 생산이 최종 운전 목적이며, 전단계인 산발효(1st stage) 공정은 가수분해 역할을 하는 용도로 쓰이지만 공정변화를 통해 바이오수소의 생산이 가능하다.
복합유기물질의 혐기성 산발효 반응 내 효율적인 수소생산을 위해서는 메탄생성균주의 대사 억제와 수소생산균의 활성을 유도하는 것이 중요하다[6,7]. 혐기성 소화 시 초기 다양한 미생물에 의해 단백질, 지방, 탄수화물의 가수분해 되는 반응과 가수분해 산물들이 발효에 의해 휘발성 지방산(Volatile fatty acids; VFAs)으로 분해되는 과정에서 수소가 발생한다. 이 후 발효 산물 중 초산(acetic acid)을 기질로 메탄을 생산(CH3COOH→CH4+CO2)하는 초산영양성 메탄생성균(acetoclastic methanogen)과 수소와 이산화탄소의 합성을 통해 메탄을 생산(4H2+CO2 → CH4+2H2O)하는 수소영양성 메탄생성균(hydrogenotrophic methanogen)에 의한 methanogenesis 반응이 진행된다. 수소기질 메탄생산 반응(hydrogenotrphic methanogenesis) 과정 중 수소가 소비된다[8]. 혐기성 슬러지의 전처리를 통해 수소영양성 메탄생성균의 생장에 제한을 받으면 메탄발생억제와 동시에 효과적인 수소생산이 가능하다[9,10,12]. 메탄 생성 균주의 활성을 억제하는 방법으로 산소 공급[9], 산처리[9], 알칼리 처리[9], lumazine[10] 나 2-bromoethanesulfonate (BES)[10]와 같은 저해물질을 주입하는 방법 등이 이용되었다. 산소 공급과 산처리 및 알칼리 처리는 기질 상태 뿐만 아니라 메탄생성균 외에 혐기성 수소생산균도 대사에 영향을 받으며 장기적 메탄생성균의 억제가 어렵다[11]. 2-BES의 경우 메탄생성균 대사 과정 중 C1 운반체 역할을 하는 coenzyme M의 억제를 통해 선택적 methanogen의 메탄생산 제어가 가능하다[12]. 또한, 수소생성균 중 Clostridium sp.와 같은 내생 포자 생성균(spore-forming bacteria)의 선택적 생장을 위해 혐기성 소화조 슬러지, 활성슬러지 등으로부터 열처리하는 방식이 다수 연구 결과에서 보고 되어왔다[13,14].
혐기성 수소발효시 전처리 방법과 접종원 및 기질의 종류에 따라 혐기성 소화 슬러지 내 미생물 군집이 변하게 되어 수소를 포함한 대사산물의 변화가 일어나게 된다. Hernández 등[15]은 셀룰로오스를 기질로 서로 다른 접종원에 열충격과 2-BES를 주입하는 전처리를 진행하여 수소생산성과 미생물 군집을 분석한 결과, 2-BES를 주입한 것 대비 열충격에 따라 미생물 군집 다양성이 감소함에 따라 수소생산성이 낮아지는 결과를 얻었다. Zhang 등[16]은 혐기성 소화 슬러지의 열, 산, 알칼리 처리, 초음파, 자외선 처리 후 옥수수 대 가수분해물을 기질로 수소생산성과 미생물 군집 변화를 분석한 결과, 각 조건마다 서로 다른 균주들(Enterobacter spp., Escherichia spp., Clostrdium spp.)이 우점하였으며 이에 따라 수소생산효율이 달라졌다. 바이오수소생산을 위해 다양한 기질의 슬러지를 접종원으로 전처리하는 여러 연구들이 진행되어왔지만, 양돈폐수와 음폐수 혼합액을 기질로 혐기성 산발효조의 열충격 및 2-BES 투입과 같은 전처리 영향에 의한 발효산물과 미생물군집구조 상호작용에 대한 연구는 바이오가스 시설의 에너지다변화 측면에서 반드시 필요하다.
본 연구는 양돈폐수와 음폐수 혼합액을 기질로 장기간 운영 중인 혐기성 소화조의 산발효조 슬러지와 메탄발효 슬러지를 채취하여 열충격과 2-BES 주입에 따른 전처리 효과를 알아보고자한다. 혐기성 반응에 있어 양돈폐수와 음폐수 비율 조절로 초기 pH를 고정하고 주요 실험 인자로 열충격과 서로 다른 농도의 2-BES 주입에 따른 메탄생산억제 및 수소생산 영향을 파악하고자 바이오가스, VFAs 및 알코올과 같은 발효산물, 미생물군집분석의 변화를 분석하여 효율적인 혐기성 수소 생산 전처리 조건을 도출하고자 한다.
2. 실험방법(또는 재료 및 방법)
2.1. 시료 및 접종원
본 실험에서 사용한 기질(양돈폐수, 음폐수), 접종원(산발효조 슬러지, 메탄발효조 슬러지)은 양돈폐수와 음폐수를 기질로 이상 혐기성 소화조를 운영하고 있는 논산시에 위치한 가축분뇨공동자원화 시설(위도 36.1806213, 경도 127.0524342)에서 모두 채취하였다. 시료 채취 후 슬러지는 고순도 질소 가스(99.999%) 주입을 통해 혐기성 환경을 조성하였으며, 기질은 성상 변화 방지를 위해 -20℃ 냉장고에 보관한 후 사용하기 하루 전 상온 조건에서 천천히 녹였다. 각 기질과 접종원 슬러지의 특성은 Table 1에 나타내었다.
Characteristics of substrates and inoculum sources.
2.2.반응기 및 운전조건
본 연구에서 사용한 반응기는 160mL serum bottle로 슬러지와 기질을 1:3 비율(15mL : 45mL)로 주입하여 혐기성 소화반응을 진행하였으며, 총 2가지 조건의 서로 다른 반응조를 운영하였다. 먼저 메탄발효 슬러지를 접종원으로 양돈페수를 기질로 이용한 메탄발효 반응조와 산발효조 슬러지를 접종원으로 양돈폐수와 음폐수를 혼합한 기질로부터 산발효 반응조를 운전하였다. 두 기질 혼합은 8:2로 진행하였으며 수소 생성에 적절한 환경인 약산성 조건(pH ~5.7) [17]으로 유지하기 위함이다. 고순도 질소를 주입하여 혐기성 조건을 조성하였고 30℃ 오븐에 넣어 회분식 반응을 진행하였다.
메탄발효조와 산발효조 내 메탄생성균 억제를 위한 전처리 방법으로써 물리적 처리인 열충격과 화학적 처리로 2-BES (BrCH2CH2SO3Na, Sigma-Aldrich, 98%)를 사용하였다. 열충격은 각 반응기 내 슬러지를 수욕조에서 90℃ 온도조건에서 15분동안 유지한 후 기질을 넣어 운전을 시작하였다. 화학적 처리의 경우 주입 농도에 따른 영향을 확인하기 위하여 메탄발효조에 2-BES를 1 mmol/L, 5 mmol/L, 10 mmol/L, 50 mmol/L, 산발효조는 1 mmol/L, 10 mmol/L, 50 mmol/L, 100 mmol/L의 농도가 되게 각 반응기에 주입하였다. 각 실험 조건에 따른 반응조의 명명은 아무 전처리를 하지 않은 대조군(BES-0; Control), 열충격만 가한 실험군(HS-0; Heat shock), 열충격을 가하지 않고 2-BES를 농도별로 주입한 실험군(BES-1, 5, 10, 50, 100)으로 메탄발효조와 산발효조로 나눠 실험을 수행하였다. 모든 반응조는 2배수로 운전하였다.
2.3. 분석 방법
실험이 진행되는 동안 각 반응조의 운전 상태를 평가하고자 12시간, 24시간, 48시간 간격으로 가스 시료를 분석하였고 1~4일 간격으로 액상 시료를 채취 후 분석하였다. 가스 분석은 Gas tight syringe (Pressure-Lok Precision Analytcial Syringe, VICI, USA)를 사용하여 반응기 내 head space 가스를 0.1mL 채취한 후 GC (YoungIn Chromass, YL-6500, Korea) 주입구에 주입하였다. 사용한 GC는 수소, 메탄, 이산화탄소 동시 분석이 가능한 Molseive 13X (3ft×1/8 in×2.1 mm) 컬럼이 장착된 열전도도검출기(GC-TCD)와 Porapak N (10 ft×1/8 in×2.1 mm) 컬럼이 장착된 불꽃이온화검출기(GC-FID)와 methanizer로 구성되어 있다. 분석 조건은 두 검출기 모두 이동상 가스로 고순도 질소(99.999%)가 15 mL/min의 유속으로 흐르게 하였으며 오븐의 온도는 40℃ 등온조건이며, GC-TCD의 주입구와 검출기 온도는 150℃, GC-FID 주입구와 검출기 온도는 각각 150℃, 250℃로 고정하였다.
액상 시료의 분석 항목은 pH, COD (Chemical oxygen demand, 화학적산소요구량), TS (Total solid, 총고형물), VS (Volatile solid, 휘발성 고형물), T-N (Total nitrogen, 총질소), T-P (Total phosphorus, 총인), NH3-N (Ammonia nitrogen, 암모니아성 질소), VFAs로 시료 채취 후 먼저 pH 측정기(913 pH Meter, Metrohm, USA)를 사용하여 pH를 측정하였다. COD, T-N, T-P는 Hach사 수질키트(Hach Compony, USA), NH3-N은 Humas사 수질키트(Humas, Korea)를 이용하여 UV/VIS spectrophotometer (DR 5000, Hach, USA)로 분석하였다. SCOD와 NH3-N는 시료를 0.2 μm 필터로 여과 후 분석을 진행하였다. TS, VS는 공정시험법 Standard method [18]를 따라 분석하였다. VFAs 분석은 AT®-Aqawax (30m×0.32mm×0.25μm) 컬럼이 장착된 GC-FID (Shimadzu, GC-2010 Plus, Korea)를 사용하였다. VFAs 분석을 위한 GC-FID 주입구, 검출기 온도 조건은 각각 250℃, 220℃로 고정하였으며 오븐 조건은 80℃에서 6분간 유지 후 12℃/min로 200℃까지 상승시켜 2분간 유지하였다. 운반기체는 30 mL/min의 고순도 질소가스를 이용하였다. 채취한 일정량의 VFAs 분석용 시료는 0.2 μm 필터로 여과 전 높은 고형물 제거를 위해 원심분리(13000 rpm, 10 min)하였으며, 시료의 산성화를 위해 0.5 mol/L H3PO4를 일정량 주입하였고 n-butanol을 내부표준물질로 이용하였다. 젖산은 UV 검출기가 장착된 HPLC (YoungIn Chromass, ChroZen HPLC, Korea)로 분석을 진행하였으며 컬럼은 Aminex® HPX-87H이며 운반용매는 5mmol/L 황산(H2SO4)로 0.6 mL/min의 유속으로 흘려주었다.
2.4. 미생물 군집 분석
혐기성 산발효 반응조의 전처리 전 후의 슬러지내 미생물 군집 분석 관찰을 위해서 각 반응기 조건인 HS-0 (0 day), HS-0 (16 day), BES-0 (0 day), BES-0 (16 day), BES-1 (16 day), BES-100 (16 day)의 슬러지를 CJ Bioscience사에 의뢰하여 분석을 진행하였다. 각 시료의 DNA 추출은 Maxwell RSC PureFood GMO 및 Authentication Kit (Promega)을 사용하여 추출하였고, PCR을 실시하였다. 프라이머는 341F (5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC– XXXXXXXX – TCGTCGGCAGCGTC – AGATGTGTATAA GAGACAG - CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)와 805R(5’-C AAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-XXXXXXXX– GTCTCGTGGGCTCGG-AGATGTGTATAAGAGACAG– GACTACHVGGGTATCTAATCC – 3’)를 사용하였다. PCR 기기의 조건은 초기 90℃에서 3분 denaturation, 95℃에서 30초 denaturation 25회 반복, 55℃에서 30초에서 primer annealing 그리고 75℃에서 30초 extension 마지막으로 75℃에서 5분 elongation을 실시하였다. 이후 1% agarose gel 전기영동을 사용해 확인하였으며, Gel Doc 시스템(BioRad, Hercules, CA, USA)를 통해 시각화하였다. 시퀀싱은 Illumina MiSeq 시퀀싱 시스템(Illumina, USA)를 사용하였다.
2.5. 분석 모델
메탄가스의 누적생산곡선을 modified Gompertz model (Eq. 1)을 적용하였다[19].
식(1)에서 M은 누적 메탄생산량(mL), P는 최대메탄생산량(mL), Rm은 최대메탄생산속도(mL/day), e는 exp(1), λ는 지체성장시간(lag growth phase time; day), t는 혐기배양기간(day)이다.
3. 결과 및 고찰
3.1. 혐기성 슬러지 전처리에 따른 가스 생산 변화
Fig. 1은 가축분뇨를 기질로 메탄발효조 슬러지의 전처리를 진행하지 않은 대조군(Control; BES-0), 열충격을 가한 조건(Heat shock; HS-0), 서로 다른 2-BES 농도를 주입한 반응기(BES-1, 10, 50, 100)를 20일간 혐기성 소화하여 생산된 누적 메탄 생산량을 Gompertz 곡선으로 나타낸 결과이다. 실험 결과 BES-0에서 가장 높은 메탄생산량을 보였으며, HS-0에서 가장 낮은 메탄가스를 생산하였다. 2-BES를 주입한 모든 반응기에서 대조군보다 메탄생산량이 감소하였고 2-BES 농도가 높아짐에 따라 메탄생산량이 좀 더 감소함을 확인할 수 있었다. 가장 높은 농도(50 mM)를 주입한 BES-50 반응기보다 HS-0에서 55.0% 수준으로 낮은 메탄생산량을 보인 결과로부터 메탄발효조 슬러지의 열충격 전처리 방법이 메탄생성균 억제에 보다 효과적이었을 것으로 판단된다(Table 2). 모든 실험 조건의 초기 pH는 7.77, 20일 이후의 pH는 7.52로 pH의 변화에 따른 메탄생산 영향은 미미한 것으로 확인되었다. 하지만 메탄발효조 슬러지로부터 수소생산은 거의 이루어지지 않아 바이오수소의 생산은 슬러지 전처리 방법이 아닌 pH, 기질 종류 등 다른 운전 요인에 의한 것으로 파악된다.
Cumulative methane production from modified Gompertz model in anaerobic methanogenic fermenter during experiment peroid.
Estimated parameters of modified Gompertz model in methanogenic fermenter sludge.
Fig. 2는 혐기성 산발효조 슬러지를 이용하여 가축분뇨와 음폐수 혼합액(8:2)의 약산성 조건(pH ~5.7)에서 앞서 메탄발효조 반응조의 비슷한 실험조건으로 16일 동안 혐기성 배양하면서 pH (Fig. 2(a))와 수소가스(Fig. 2(b)) 및 메탄가스(Fig. 2(c))의 시간에 따른 변화를 분석한 결과이다. HS-0 반응기를 제외한 모든 반응기에서 운전 후 36 h에 최고 수소 발생량을 기록하였다. 하지만 열충격을 가한 HS-0반응기에서는 48 h 이후부터 수소발생이 시작되어 72 h에 최고 수소생산량을 나타내었다. 이러한 수소 생산 반응 지연은 Clostridium spp.와 같은 수소생산균의 열충격으로 인한 균체 내 일부 유전자의 스트레스로 인해 지체기(lag phase)가 길어진 것과 상관되는 것으로 추정된다[20]. 산발효조 슬러지의 전처리를 진행하지 않은 대조군인 BES-0은 초기 급격한 수소생산 이후 60 h부터 지속적으로 감소하여 16일부터 검출되지 않았다. Fig. 2(c)에서 BES-0의 메탄가스의 농도는 수소농도가 감소한 60 h부터 발생량이 지속적으로 증가하기 시작하였는데, 이러한 현상은 따로 메탄생성균 생장을 억제하지 않은 결과로 H2와 CO2를 합성하여 CH4를 생산하는 수소영양성 메탄생성균의 생장에 의한 것으로 추정된다[21]. 미생물 군집 분석 결과 대부분 이러한 메탄생성균이 우점한 것으로 확인되었다(Fig. 4). 2-BES를 주입한 모든 반응기에서는 반응종료시점까지 메탄가스가 검출되지 않았으나, 열충격 전처리한 반응기에서 14일 이후부터 메탄가스가 분석되었다. 이러한 결과들은 앞서 메탄발효조 슬러지 전처리 방법 결과와 다르게 산발효조 슬러지에서는 2-BES 투입이 열충격 방법보다 메탄생성균 성장 억제 측면에서 유리하다고 판단된다. 또한, 산발효조 슬러지로부터 수소발효시 적정 2-BES 주입 농도는 1 mmol/L 이하로 유지시키는 것이 지속적인 수소생산과 약품투입의 경제적인 측면에서 유리하다고 판단된다. 한편, 2-BES를 주입한 반응기의 수소가스 생산 수율은 46.0~87.1 mL H2/g VS로 대조군보다 약 34.9~87% 정도의 수소 수율 향상되었으며, HS-0의 수소가스 생산 수율은 31.6±1.2 mL H2/g VS로 2-BES보단 낮은 결과를 보였다(Table 3).
Changes in (a) pH, (b) cumulative hydrogen production, and (c) cumulative methane production of the control, 2-BES, and heat shock pretreated anaerobic acid fermenters during experiment period.
Relative abundance at (a) phylum, (b) genus, and (C) species level in bacteria community changes and (d) phylum, (e) genus, and (f) species level in archaea community changes in the anaerobic acid fermenters.
Evolution of VS, TCOD, SCOD, and T-N concentration, average removal efficiency (RE), and H2 yield during anaerobic acid fermentation.
3.2. 혐기성 산발효 전 후의 산물 변화
혐기성 산발효 전 후의 유기물 농도의 변화를 분석한 결과 VS의 제거율은 대조군과 HS-0에 비해 2-BES 주입한 반응기에서 낮았으며 2-BES 주입농도가 높을수록 낮은 제거율을 보였다(Table 3). 혐기성 산발효 주입 평균 TCOD, SCOD 농도는 각각 44,083 mg/L, 40,833 mg/L였으며 각 실험군에 따른 16일 이후 TCOD 제거율은 3.7~7.1%로 SCOD 제거율은 0.5~16.0%로 큰 차이를 보이지 않았다.
총 VFAs의 농도 또한 반응 전후 변화가 크진 않았지만 미생물 반응 시간에 따라 각 VFAs와 알코올의 농도 변화가 관찰되었다(Fig. 3). 반응 초기 양돈폐수와 음폐수의 혼합액에서는 초산(Acetic acid), 젖산(Lactic acid), 에탄올(Ethanol), 프로피온산(Propionic acid)이 각각 평균 44%, 21%, 13%, 7% 순으로 높은 비율을 차지하고 있었으나 반응 종료 후 고농도 순 초산, 낙산(Butyric acid), 프로피온산, 발레르산(Valeric acid), 카프로산(Caproic acid)으로 주 발효산물의 비율이 변화하였다. 혐기성 산발효 반응 동안 모든 반응기에서 젖산과 에탄올이 대부분 소비되었고 프로피온산, 낙산, 발레르산, 카프로산이 추가 생산되었다. 초산의 농도는 반응기마다 다르지만 상대적으로 큰 변화가 일어나지 않았다. 혐기성 소화 과정 중 가수분해 혹은 산발효에 의해 초산, 프로피온산, 낙산, 발레르산이 생산된다. 혐기성 발효 관련 미생물 대사에 따르면 1 mol의 포도당이 분해되는 동안 초산 및 낙산은 각각 4몰(식 3), 2몰(식 4)의 수소를 생산할 수 있어 초산과 낙산 농도 증가는 수소발생량과 밀접한 관계가 있으며 일부 수소생산균 중 젖산을 생산하는 젖산발효균은 대사과정 중 수소를 생산한다. 본 실험에서는 초기 젖산 농도가 증가하지 않고 오히려 감소하는 반응은 초산과 젖산의 합성을 통한 낙산의 생산량을 증가하는 발효 경로가 추가로 일어났을 것으로 추정된다(식 5) [22]. 모든 조건에서의 카프로산의 농도 증가는 에탄올과 초산의 합성에 의해 발생[23] 할 수 있는데(식 6), Fig. 3(f)에서 8일 이후 에탄올 농도 감소함에 따라 카프로산 농도의 증가하는 결과는 이러한 반응에 의한 것으로 해석 가능하다.
Changes of VFAs concentrations in (a) BES-0 (control), (b) BES-1, (C) BES-10 (d) BES-50, (e) BES-100, and (f) HS-0 in anaerobic acid fermenters.
각 반응 조건별로 시간에 따른 VFAs와 알코올 농도 변화를 살펴보면, 2-BES를 주입한 모든 반응기에서 VFAs과 에탄올의 농도가 비슷하게 변화하였다(Fig. 3(b)-3(e)). 젖산과 에탄올의 농도는 3일 이내 시간동안 급격히 감소한 후 검출되지 않았으나 낙산, 프로피온산, 발레르산, 카프로산의 농도는 3~4일 동안 증가하여 비슷한 농도를 유지하였다. 이러한 시간에 따른 발효산물의 변화는 Fig. 2(a), 2(b)의 산발효균에 의한 pH와 수소생산변화와 밀접한 관계가 있음을 확인할 수 있었다. 대조군인 BES-0에서도 2-BES를 주입한 조건들과 비슷한 수소생산과 VFAs 농도 변화가 관찰되었으나 초산의 경우 다른 반응과 다르게 8일 이후 초산의 생산량이 증가하였다. 이는 Fig. 2(b)와 Fig. 2(c)에서 수소영양성 메탄생성균의 수소와 이산화탄소로부터 메탄생산에 따른 수소분압 감소로 syntrophic association에 의한 에탄올의 아세테이트 전환(식2)에 따라 농도가 증가한 것으로 추정된다(Fig. 3(a)). HS-0의 경우 다른 반응기에 비해 지체기가 길어져 2일 이후 수소가 발생하는 늦은 반응으로 인해 낙산, 프로피온산, 발레르산의 경우 2일 이후부터 농도가 상승하였고 8일 이후부터는 에탄올의 농도가 감소하고 카프로산은 증가하기 시작하였다(Fig. 3(f)). 카프로산 발효 반응은 메탄생성균중 초산을 이용하여 메탄을 생성하는 acetoclastic methanogens이 억제된 조건에서 카프로산 발효가 가능하나 이러한 카프로산 발생은 높은 수소 생산 효율 측면에서 부정적이다[24].
3.3. 미생물 군집분석
산발효 슬러지의 열충격과 농도 별 2-BES 주입에 따른 미생물 변화를 확인하기 위해 원 슬러지(Initial sludge)와 배양 16일 후 BES-0 (control), BES-1, BES-100의 슬러지, 원 슬러지에 열충격을 진행한 초기 슬러지(Heat shock 0d), 16일 이후 슬러지(Heat shock 16d)의 고세균(Archaea)과 박테리아(Bacteria)의 군집 분석을 진행하였다. 균주의 다양성 분포를 알아보기 위한 고세균 및 박테리아 군집의 알파 다양성 지수(Shannon Index, Chao 1, OTUs, Simpson, ACE, Phylogenetic diverstiy)를 Table 4에 나타내었다. 종 균등성(evenness)의 지표인 Shannon Index 에서는 모든 반응기에서 박테리아(평균 3.25)가 고세균(평균 1.25)보다 약 2.6배 높은 지수를 보였으며, OTUs를 비롯한 종 풍부도(richness)의 지표인 ACE, Chao1 또한 고세균 대비 접종된 산발효 슬러지 내에 박테리아의 군집에서 월등히 높았다. 이는 음폐수와 양돈폐수가 기질로 사용된 혐기 소화 연구 결과[25], 실증 혐기성 소화조 내 미생물 종 분석 결과[26]와 일치하는 결과를 보였다. 본 실험의 산발효 시 고세균에 대한 유의미한 차이는 없었던 것으로 보이며 높은 비율을 차지한 박테리아 종이 대부분 유기성 기질의 분해에 직접적으로 관여하여 중간대사 산물을 생성한 것으로 판단된다[27,28]. 박테리아 종의 알파 다양성 지수 결과, 초기 슬러지와 열충격(0d) 슬러지에서 발효 직후 대비 Shannon Index를 비롯한 Chao 1, ACE, Phylogenetic diversity 등이 월등히 높은 것으로 확인되었다. 열충격을 가한 발효 초기 슬러지에서 가장 높은 수치를 확인하였고, 발효 후의 반응기들은 서로 유사한 수치를 기록하였다. 열충격 전처리 시 발효초기에 다양한 종들의 출현과 동시에 다양성이 높았으나, 발효가 끝난 모든 반응기에서 낮은 수치일수록 종간의 계통학적 특성이 높다는 지표인 Phylogenetic diversity의 낮은 결과로 특정 종들의 활성화 및 분포가 커짐에 따라 박테리아 군집의 다양성이 줄어든 것으로 판단된다. BES-100에서 또한 박테리아 군집의 다양성이 가장 감소한 수치를 보였으며, 이는 열충격을 가한 반응기 보다 낮은 수치의 결과로 고농도의 2-BES 주입이 혐기성 산발효 반응 중 생태다양성을 줄일 수 있는 화학물질이라 판단된다.
Alpha diversity indices of archaea and bacteria group in anaerobic acid fermenter sludge
혐기성 소화 반응 전 후 시료의 박테리아 군집 분석결과를 문, 속, 종으로 나누어 Fig. 4에 나타내었다. 문(phylum) 분석결과(Fig. 4(a)), 초기 원 슬러지(Initial sludge)와 열충격을 가한 초기 슬러지(Heat shock 0 d)에서 Firmicutes은 각각 62.4%, 79.9%의 비율에서 16일 배양 후 모든 조건에서 93.1% 이상 비율이 증가하였다. 초기 원 슬러지에서는 Firmicutes 이외에 Bacteroidetes (10.8%), Synergistetes (4.1%), Tenericutes (1.1%), Proteobacteria (1.0%)의 비율을 보였으나 열충격 후(0 d) Bacteroidetes (21.0%), Spirochaetes (5.98%), Cloacamonas_p (4.7%), Tenericutes (1.6%), Proteobacteria (1.0%)로 각각 비율이 증가하고 Firmicutes와 Synergistetes (2.4%)의 비율은 감소하였다. 이 중 Spirochaetes, Cloacamonas_p는 열충격(0d)에서만 검출되었다. Phylum계열의 대부분을 차지하는 Firmicutes는 다양한 기질을 분해하고 아세트산과 같은 VFAs를 생성할 수 있는 균주들이 다량 포함되어 혐기성 소화 과정 중 가수분해 및 산생성단계에서 주로 발견된다[29,30]. Bacteroidetes 또한 가수분해 및 산 생성 단계에서 자주 발견되는데 이는 단백질분해가 가능하며 암모니아와 VFAs의 높은 농도에 내성을 가진 균주가 다량포함되어 있는 것으로 판단된다[31]. Hu Yu-ying 등[32]의 연구에서는 열처리된 양돈분뇨 기질에서 Bacteroidetes의 높은 비율을 확인하였으며, 이는 본 실험의 열충격 초기(0d)에서 Bacteroidetes의 높은 비율 결과와 유사하였다. 또한 Bacteroidetes는 초기 슬러지에서도 10.9%를 차지하였으나 발효 후 BES 농도가 높을수록 비율 감소현상을 보였다(Control 3.2% > BES-1 1.3% > BES-100 0.1%). 이러한 결과는 2-BES 농도가 Bacteroidetes 군집형성에 영향을 미치는 요인인 것으로 추정된다. 이외에 열처리시에만 출현된 Spirochaetes, Cloacamonas_p은 혐기성 소화조 내 종종 발견되는 균주로[33,34] Spirochaetes는 아세트산 산화와 관련있다는 보고가 있으나[35] 이들의 생태학적 역할에 대한 연구는 아직 불분명하다.
Fig. 4(b)의 속(genus) 분석 결과, 다양한 균주들이 검출되었으며 그 중 Clostridium이 초기 원슬러지 37.2%, 발효 후의 Control 35.9%, BES-1 38.5%, BES-100 59.2%, Heat shock 0 d 28.1%, Heat shock 16일 후 41.6%으로 높은 비율을 보였다. Clostridium은 혐기성 균주로 당을 활용하여 수소를 생산하며 극한의 환경에서 내생 포자를 형성하는 대표적인 수소생산균이다[25,36]. 앞서 바이오가스 생산 결과(Fig. 2)로부터 열충격과 2-BES 주입이 메탄 생성 균주 억제와 동시에 수소생산균주의 성장을 촉진하는 환경을 조성한 것으로 판단된다. 종 (species) 분석결과(Fig. 4(c)), 대부분의 Clostridium은 Clostridium PAC00136_s (21.4-47.3%), Clostridium butyricum (4.1-8.7%)로 분석되었다. C. butyricum은 잘 알려진 수소생산 균주로 포도당으로부터 낙산, 젖산, 아세트산 등을 주요 부산물로 생산하는 균주이다[37,38]. 수소생산과 직접적인 연관이 있는 C. PAC00136_s 및 C. butyricum은 2-BES의 농도가 높을수록 차지하는 비율도 높았으며, 전처리가 진행되지 않는 조건에서는 상대적으로 낮은 비율을 확인했다. 모든 조건의 16일 배양 후 Lactobacillaceae 속의 급격한 비율 증가를 확인했다. Lactobacillaceae는 열충격 시 발효 전 후 비율이 6% 증가하였고 BES 주입의 경우 7.6-14.4%의 비율 상승을 보였다. 동일 계열의 Lactobacillus 또한 열충격시 검출되지 않았다가 발효 후에 1.7%에서 4.2%로 증가하였다. 이 속에 속한 균주는 산생성단계에 관여하여 젖산이나 낙산을 방출하며[39], 산발효시 수소생산에 직접적으로 관여한다는 보고는 없지만 젖산을 생성하는 동안 수소생산균인 Clostridium이 이를 이용해 낙산 및 수소를 발생시키기에 두 균주가 양적인 상관관계를 가진다는 연구 결과가 보고되었다[40]. 본 실험의 모든 조건에서 낙산의 초기농도 대비 1.4-1.9배 증가, 젖산의 초기 높은 농도, Clostridium 균주의 높은 비율 및 수소발생의 결과를 바탕으로 Lactobacillaceae 균주가 수소생산에 기여한 것으로 판단된다. Anaerosalibacter는 발효 후 BES-0, BES-1에서 약 7.2% 관찰되었는데 이 균주는 탄소화합물 분해로부터 단쇄지방산(short fatty chain acids)를 생산하며 주로 카프로산 생산에 기여한다는 보고가 있다[40]. 카프로산 생산과 연관된 균주인 Caproiciproducens 또한 발효 후 조건들에서 관찰됨(3%미만)과 동시에 Figure 4의 초기 농도 대비 모든 조건에서 카프로산 생산은 Anaerosalibacter와 Caproiciproducens 균주의 작용으로 추측된다[41]. Terrisporobacter은 모든 조건에서 약 4.5-9.1% 발견되었는데 이 균주는 acetogenic bacterium으로 아세트산을 생성하는 종으로 알려져있다[42]. 이외에 Sphaerochaeta, Cloacamonas_f_uc, Prevotella, Turicibacter, Fermentimonas, Romboutsia 등이 5%미만 검출되었으며, 이 중 Sphaerochaeta, Cloacamonas, Prevotella, Fermentimonas 균주만 열충격 초기 반응기에서 확인되었다.
고세균 군집 또한 문, 속, 종으로 나누어 Figure 4(d)-4(f)에 나타내었다. 문(phylum) 분석 결과, 모든 반응기 조건에서 메탄생성균이 속한 Euryarchaeota [43,44]가 99.7-100% 우점하였다(Fig. 4d). Figure 4e의 속(genus)에서 원 슬러지에서 절대 혐기성 고세균으로 수소를 통해 이산화탄소를 환원시켜 메탄을 생성하는 hydrogenotrophic methanogens인 Methanobrevibacter, Methanosphaera가 각각 86.2%, 8.2%의 높은 비율로 우점하였다. 종(species) 분석에 따라 Methanobrevibacter은 pH 6.0 및 높은 아세테이트 농도 조건에서 잘 성장하는 하는 것으로 알려져있는[45] M. acididurans 종, Methanosphaera은 메탄올과 수소로부터 메탄을 생산하는 M. cuniculi 종이 대부분인 것으로 확인되었다. Margarita Ros 등[25]의 음식물 탈리액 및 양돈 폐수 혼합물 이용한 혐기 소화 시 양돈 폐수의 비율을 50~60% 증가시킬 경우 수소영양성 메탄생성균인 Methanosphaera 및 Methanobrevibacter 균주 비율이 증감된 결과를 바탕으로 본 실험에서 이러한 균주의 높은 비율은 양돈폐수와 음폐수 혼합기질의 특성에 따른 결과로 판단된다.
2-BES 주입과 열충격 전처리에 따라 반응기 내 메탄생산은 물리화학적 전처리를 하지 않은 대조군에서만 발생하였는데, 16일 배양 후 Methanobrevibacter는 76%, Methanosphaera은 20%로 비율로 변화가 있었으나 여전히 높은 미생물 군집 비율을 차지하였다. 원 슬러지에서 초산을 이용한 메탄생성균인 acetotrophic methanogens [46]에 속하는 Methanosarcina (3.3%) 및 Methanosaeta (2.5%)의 총 합 비율이 5.8%에서 16일 이후 3.7% (Methanosarcina 0.2%, Methanosaeta 3.5%)의 비율이 변화한 결과와 초산의 농도 변화가 거의 일어나지 않은 것으로 보아 대조군에서는 메탄가스 생산은 초산 소비 경로로 이루어 진 것이 아닌 hydrogentrophic methanogens에 의해 수소 소비가 일어났음을 다시 한번 확인할 수 있었다. 또한, 고염 환경에서 메탄올과 수소 소비에 따라 메탄생산종으로 분류된 Methanogranum은 초기 0.1% 미만의 비율에서 16일 후 1.8%로 증가한 군집 비율을 보였다. 이는 기질의 높은 염분 농도에 기인한 것으로 추정되며 Fig. 2(b)-2(c)의 결과에서 12일 이후 수소농도의 감소와 메탄생산의 증가에 일부 기인하였을 것으로 추정된다
4. 결론
본 연구에서는 양돈폐수와 음식물 탈리액 혼합액을 기질로 열충격과 2-BES 주입을 통한 메탄발효조와 산발효조의 수소 생성 효율과 메탄생성균 억제 효과를 평가하고자 하였으며 발생한 가스, 휘발성 지방산과 알코올과 같은 발효산물, 미생물 군집 및 다양성 분석을 통해 최적 전처리 조건을 도출해냈다. 메탄발효조 슬러지의 열충격 방법이 2-BES 주입 방법보다 메탄생성균 억제에는 효과가 있었으나 모든 전처리 방법에서 수소생산에는 영향이 없었다. 산발효조 슬러지는 전처리 여부에 상관없이 Clostridium spp.의 우점에 의한 낙산 생산으로 인해 모든 조건에서 수소가스가 발생하였으나 전처리 하지 않을시 Methanobrevibacter와 Methanosphaera 속 고세균과 같은 수소영양성 메탄생성균의 대사에 의해 발생된 수소가 메탄가스로 전환되는 문제가 발생하였다. 효율적인 혐기성 수소 생산을 위해서는 산발효조 슬러지에 수소생산균의 지체기의 지연 문제와 메탄생성균 억제 지속력이 약한 열충격 방법보다 적정농도의 2-BES 사용(1 mmol/L 이하)이 수소생산속도와 지속적인 메탄생성균 억제 측면에서 적정한 방법이라 파악된다. 향후 현장적용을 위해 후속메탄생산공정을 고려한 보다 더 경제적이며 효율적인 전처리 방법과 운전 방법을 찾는 후속 연구가 필요할 것으로 사료된다.
Acknowledgements
본 연구는 조선대학교 학술연구비의 지원을 받아 수행되었습니다(2020). 이에 감사드립니다.
Notes
Declaration of Competing Interest
The authors declare that they have no known competing interests or personal relationships that could have appeared to influence the work reported in this paper.