Extraction of Chitin from Shrimp Shells using Microwave: Optimization of Protein Removal based on Central Composite Face-centered Design

Lee, Geon-Ho; Jang, Min-Jeong; Jung, Jong-yeon; Ahn, Johng-Hwa

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J Korean Soc Environ Eng > Volume 47(2); 2025 > Article

마이크로웨이브를 활용한 새우 껍질로부터 키틴 추출: 면 중심 합성 설계 기반 단백질 제거 최적화

Research Paper

Journal of Korean Society of Environmental Engineers 2025; 47(2): 98-109.

Published online: February 28, 2025

DOI: https://doi.org/10.4491/KSEE.2025.47.2.98

마이크로웨이브를 활용한 새우 껍질로부터 키틴 추출: 면 중심 합성 설계 기반 단백질 제거 최적화

이건호¹

, 장민정¹

, 정종연¹

, 안종화^1,^2,^†

¹강원대학교 건축토목환경공학부

²강원대학교 에너지인프라융합학과

Extraction of Chitin from Shrimp Shells using Microwave: Optimization of Protein Removal based on Central Composite Face-centered Design

Geon-Ho Lee¹

, Min-Jeong Jang¹

, Jong-yeon Jung¹

, Johng-Hwa Ahn^1,^2,^†

¹Division of Architectural, Civil, and Environmental Engineering, Kangwon National University, Republic of Korea

²Department of Integrated Energy and Infra System, Kangwon National University, Republic of Korea

^†Corresponding author E-mail: johnghwa@kangwon.ac.kr Tel: +82-33-250-6357

Received December 4, 2024 Revised January 24, 2025 Accepted January 30, 2025

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Abstract

The objective of this study is to extract chitin from shrimp shells by removing minerals and proteins using a microwave heating method. The optimal conditions for protein removal were proposed using response surface analysis. Experiments on mineral removal were conducted under discontinuous conditions with irradiation time (1~5 min), temperature (90~130℃), and irradiation power (400~1,600 W). Following the mineral removal process, protein removal experiments were performed under discontinuous conditions with irradiation time (1~10 min), temperature (40~100℃), and irradiation power (400~1,600 W). To identify the optimal points and interactions between factors for protein removal on a continuous scale, the central composite face-centered design, a type of response surface analysis, was employed. Independent variables were set as temperature (40~100℃) and irradiation power (600~1,600 W). Under discontinuous conditions, mineral removal experiments resulted in over 99.9% mineral removal efficiency at 3 min, 100℃, and 1,600 W. For protein removal, maximum efficiency of 94.9% was observed at 3 min, 40℃, and 1,600 W. Lower temperatures resulted in higher protein removal efficiency. Higher irradiation power led to increased protein removal efficiency. The optimal conditions for protein removal in continuous scale experiments were found to be 40℃ and 1,600 W. Under these conditions, a removal efficiency of 95% was achieved. All independent variables significantly influenced the removal process using microwave heating, with p<0.05. The chitin extracted in this experiment exhibited an α-chitin structure with a crystallinity of 84.5%, which is higher than that of commercial chitin (82.1%). Observation of the chitin surface confirmed increased porosity and the removal of minerals and proteins. Mineral removal achieved over 99.9% removal efficiency at 3 min, 100℃, and 1,600 W. The optimal conditions for protein removal in chitin extraction from shrimp shells are 40℃ and 1,600 W. The extracted chitin has an α-chitin structure with a crystallinity of 84.5%. Thus, microwave heating can be used as an effective pretreatment method for mineral and protein removal in chitin extraction from crustaceans.

Key words: protein removal, microwave, response surface analysis, shrimp shell, chitin

요약

새우껍질 내 키틴(chitin)을 추출하기 위하여 마이크로웨이브(microwave)가열 방법으로 미네랄과 단백질을 제거하고자 한다. 미네랄 제거 후 반응표면법을 이용하여 단백질 제거를 위한 최적 인자조건을 제시하고자 하였다. 비연속적 조건에서 조사 시간(1~5분), 온도(90~130℃), 조사 강도(400~1,600 W) 등에 따른 미네랄 제거에 관한 실험을 하였다. 미네랄 제거 과정을 거친 후 단백질 제거 실험은 비연속적 조건에서 조사 시간(1~10분), 온도(40~100℃), 조사 강도(400~1,600 W) 등에 따른 실험을 진행하였다. 연속적인 스케일에서 단백질 제거를 위한 인자 간의 최적점과 상호작용을 확인하기 위해 반응표면분석법(response surface analysis) 중 면 중심 합성 설계(central composite face-centered design)를 사용하였다. 독립인자는 온도(40~100℃), 조사 강도(600~1,600 W)로 설정하였다. 비연속적 조건에서 미네랄 제거 실험 결과, 조사 시간 3분, 온도 100℃, 조사 강도 1,600 W에서 99.9% 이상의 미네랄 제거율을 달성하였다. 또한 단백질 제거 실험의 경우 조사 시간 3분, 온도 40℃, 조사 강도 1,600 W에서 최대 94.9%의 단백질 제거율을 보였다. 온도는 낮을수록 단백질 제거율이 높았다. 조사 강도가 증가할수록 단백질 제거율은 높았다. 연속적인 스케일에서 단백질 제거의 최적 조건은 온도 40℃, 조사 강도 1,600 W로 나타났다. 이때의 제거율은 95.0%이다. 모든 독립 변수가 p<0.05으로 마이크로웨이브 가열방식의 제거에 유의미한 영향을 주었다. 본 실험에서 추출한 키틴은 α-키틴 구조를 가지며, 결정화도(crystallinity)가 84.5%로 상업용 키틴(82.1%)보다 높았다. 키틴 표면을 관찰한 결과, 다공성이 증가하고 미네랄과 단백질이 제거됨을 확인하였다. 미네랄 제거는 조사 시간 3분, 온도 100℃, 조사 강도 1,600 W에서 99.9% 이상의 높은 미네랄 제거율을 달성하였다. 새우껍질에서 키틴을 추출하기 위한 최적 단백질 제거 조건은 온도 40℃, 조사 강도 1,600 W이다. 추출된 키틴은 α-키틴 구조를 가지며, 결정화도가 84.5%로 나타났다. 따라서 마이크로웨이브 가열은 갑각류로부터 키틴 추출 시 미네랄 제거와 단백질 제거 등을 위한 효과적인 전처리 방법으로 사용할 수 있다.

주제어: 단백질 제거, 마이크로웨이브, 반응표면분석법, 새우껍질, 키틴

1. 서 론

가공 산업에서 발생하는 해양 폐기물의 발생량이 매년 증가하고 있는 가운데 1961년 전체 수산물 소비 중 갑각류는 14%를 차지했지만, 2019년에는 26%로 갑각류 폐기물의 비중이 늘어나고 있다[1]. 이러한 폐기물은 병원균, 유기 물질 등으로 환경 오염 문제를 발생시켜 회수 과정의 개발이 필요하다[2]. 갑각류 폐기물은 주로 게, 새우, 가재 같은 수산물들이 주를 이루며 이 중 새우 종이 가장 많은 비중을 차지하고 있다[3]. 2021년 기준 전 세계 양식 새우가 7,334,000톤 생산되었으며, 이는 전체 갑각류 중 79.6%로 가장 높은 비중을 보인다[1]. 일반적으로 새우 가공 과정에서는 50~60%가 새우 머리와 껍질과 같은 폐기물로 버려지고 있다[4]. 그러나 새우껍질은 단백질, 미네랄, 키틴(chitin)을 함유해 고부가 가치를 가진 잠재적 자원 및 상업용 키틴의 가장 중요한 공급원으로 사용될 수 있다[2,5]. 따라서 새우껍질에서 키틴을 회수하는 것은 유익하며 환경 오염 문제를 줄이는데 도움이 된다[5].

키틴은 셀룰로오스 다음으로 지구에서 두 번째로 풍부한 생물학적 고분자로, N-아세틸-D-글루코사민(N-Acetyl-D-Glucosa mine) 단위로 구성된 다당류이며 갑각류의 껍질 등에 존재한다[2]. 키틴은 고분자 사슬의 배열에 따라 반평행(anti-parallel) 구조인 α-키틴, 평행(parallel) 구조인 β-키틴, 교차(alternated alignments) 구조인 γ-키틴으로 분류된다. 이 중 α-키틴은 주로 갑각류의 외골격에서 얻어진다[6]. 새우껍질에서 추출한 α-키틴은 구조적으로 안정적이고 풍부한 다형체로서 산 처리 후 알칼리 처리를 통해 키토산[7,8] 등과 같은 주요 자원을 생산하는 곳에 쓰인다[2,6].

새우껍질에는 α-키틴 15~40%, 단백질 20~40%, CaCO₃ 20-50% 및 색소와 기타 미네랄로 구성되어 있다[6]. 새우껍질로부터 α-키틴을 추출하기 위해서는 효소를 이용한 생물학적 방법, 일반 화학적 추출법, 가열을 이용한 화학적 추출법 등 다양한 방법이 제안되고 있다. 일반 화학적 추출법은 실온에서 장시간 화학적 반응을 통해 추출하는 방법이며, 가열을 이용한 화학적 추출법은 기존 화학적 추출법에 열을 추가하여 사용한 방법이다[2,6]. 이 공정은 CaCO₃ 및 Ca₃(PO₄)2과 같은 무기물을 희석된 HCl 산성 용액으로 제거하는 미네랄 제거 단계와 단백질을 NaOH, KOH와 같은 알칼리성 용액으로 추출하는 단백질 제거 단계로 이루어져 있다. 영향을 주는 인자로는 반응 시간, 온도, 입자 크기, 산성 용액의 종류와 농도, 알칼리성 용액의 농도와 종류, 고체와 액체의 비 등이 있다[6]. 이러한 과정은 높은 함량의 단백질과 미네랄을 제거해 고순도의 키틴을 생성할 수 있어 선호되는 키틴 추출 방법이다[5]. 일반적인 가열방법(conventional heating)을 사용하는 화학적 키틴 추출 방법은 긴 반응 시간, 높은 에너지 소비 등의 단점이 존재한다. 이러한 단점을 보완하기 위해 마이크로웨이브(microwave) 기술이 연구되어지고 있다[2].

마이크로웨이브는 교류 전기장을 이용해 극성 물질의 진동을 일으켜 전자기 에너지를 열 에너지로 변환하여 화학 반응을 가속화하는 기술이다[9,10]. 이 마이크로웨이브 기술은 반응 속도 증가, 반응 시간 단축, 에너지 절감 등의 장점이 존재해 유기화합물의 효율적인 추출을 위한 기술로 사용되고 있다[11,12]. 키틴 추출을 위한 선행 연구에서는 가정용 마이크로웨이브만을 사용해 조사 강도(90~650 W), 시간 등에 따른 실험을 진행하였다[7,10,11]. 하지만 가정용 마이크로웨이브로는 인자 조절이 어렵기 때문에 조사 강도, 온도 등을 최적화하기 위해서는 Microwave accelerated reaction system (MARS 5)등과 같은 마이크로웨이브 기기를 도입할 필요가 있다.

반응표면분석법(response surface analysis, RSA)은 독립 변수와 종속 변수 간의 관계를 이해하기 위해 수학적 모델을 구축하여 변수들 간의 상호작용과 영향력의 가중치를 파악하는데 사용하는 효과적인 최적화 실험 계획법이다[13]. 이러한 계획법은 최적의 운영 조건을 찾기 위해 개발되었으며 현재 여러 분야에서 프로세스, 실험, 시스템 등을 설계하고 최적화하는 데 사용되고 있다[14]. 반응표면분석법은 통계적 및 수학적 기법을 결합하여 응용 프로세스를 개선하고 최적화하며 이는 과도한 실험 횟수를 줄이면서도 비슷한 정확도로 데이터를 얻어 시간과 비용을 절약할 수 있다는 장점을 가지고 있다[15].

본 연구는 새우껍질 내 미네랄과 단백질을 제거하기 위해 마이크로웨이브 기기를 사용해 효과적인 키틴 추출 방식을 제안하고자 한다. 또한 실험 설계 시 반응표면분석법을 사용해 연속적인 스케일에서 마이크로웨이브의 온도와 조사 강도를 독립인자로 설정해 단백질 제거 과정에서의 인자 간의 상관관계와 최적점을 도출하고자 한다.

2. 재료 및 방법

2.1. 새우껍질

흰새우(Litopenaeus vannamei)는 2021년 전 세계 갑각류 양식 생산량 중 약 53%(6,300,000톤)을 차지하여 본 실험의 키틴을 추출하는 자원으로 활용했다[1]. 흰 새우는 새우몰(saewoomall.co.kr)에서 구입하고 기존의 화학적 처리를 거친 상업용 키틴은 Tokyo Chemical Industry(일본)에서 구입하였다. 키틴 추출에서 용액은 HCl(37%)(대정화금)과 NaOH(펠릿, 97%)(포바이오코리아)를 사용하였다. 새우껍질은 수돗물로 세척한 후 드라이 오븐(VS-1202D3N, 비전과학)에서 80℃로 24시간 동안 건조하였다. 건조된 새우껍질은 분쇄하여 200 µm체를 통과시킨 후 지퍼팩으로 냉장(4℃이하) 보관하였다.

2.2. 키틴 추출을 위한 전처리

본 연구는 조사 강도(0~1,600 W)와 센서를 통해 온도 조절이 가능한 마이크로웨이브 MARS 5 (CEM Corporation, 2,450 MHz, 최대출력 1,600 W)를 이용하였다.

2.2.1. 미네랄 제거

미네랄 제거 과정에서 고정인자는 건조된 새우껍질 가루와 3M HCl 용액의 비율을 1:10으로 혼합하고 자석 교반기(DH.WMH 03020, 대한과학)를 이용하여 교반 속도 300 rpm, 교반 시간 30분으로 하였다[16]. 미네랄 제거의 영향인자 실험은 조사 시간 1~5분, 온도 90~130℃, 조사 강도 400~1,600 W의 범위에서 진행하였다[10]. 미네랄 제거 과정을 거친 새우껍질 가루를 여과하고, pH meter(UB-10, Denver Instrument, 미국)를 이용하여 pH 7이 될 때까지 증류수로 세척한 다음, 드라이 오븐 80℃에서 밤새 건조하였다. 건조 후 도가니에 무게를 재고 전기 용광로(MF-21G, 제이오텍)를 이용하여 600℃에서 4시간 강열하여 2시간 냉각시켜서 무게를 재어 미네랄 제거 효율을 계산하였다(식 1) [17,18].

(1)

Mineral removal (%) = [(Ao×O)-(AR×R)]×100/(Ao×O)

여기서, A_o은 새우껍질의 회분함량(g/g), O은 새우껍질의 질량(g), A_R은 미네랄 제거 과정을 거친 새우껍질의 회분함량(g/g), R은 미네랄 제거 과정을 거친 새우껍질의 질량(g)이다.

2.2.2. 단백질 제거

미네랄 제거 후 단백질 제거 과정에서 고정인자는 새우껍질가루와 10% NaOH 용액의 비율을 1:10으로 혼합하고 자석 교반기를 이용하여 교반 속도 300 rpm, 교반 시간 30분으로 하였다 [16]. 단백질 제거의 영향인자 실험은 조사 시간 1~10분, 온도 40~120℃, 조사 강도 400~1,600 W의 범위에서 실험을 진행하였다 [10]. 이와 같이 처리된 새우껍질을 여과하고, pH 7이 될 때까지 증류수로 세척한 다음, 드라이 오븐 80℃에서 밤새 건조하였다. 이 때 얻어진 생산물을 microwave assisted extraction method chitin(ME-키틴)으로 명명하였다. ME-키틴과 1% NaOH 용액의 비율을 1:10으로 하여 하루동안 용해시켰다. 용해한 혼합물은 GF/C 필터를 이용하여 여과한 후 자외선/가시선 분광광도계(UV-VIS spectrophotometer, Livra S60, Biochrom, 영국)로 280 nm와 260 nm에서 흡광도를 측정한 후 Warbrug-Christian method을 이용하여 단백질 함량을 계산하였다(식 2) [10].

(2)

Protein (mg/mL) = (A280 × 1.31-A260 × 0.57)

여기서, A₂₆₀은 260nm, A₂₈₀은 280nm에서 측정된 흡광도이다.

2.3. 면 중심 합성 설계

실험 설계를 위해 2차 모형의 추정을 위한 연구에 일반적으로 사용되는 최적화 알고리즘인 반응표면분석법 중의 하나인 면 중심 합성 설계(central composite face-centered design)를 적용하였다[19,20]. 단백질 제거효율에 영향을 미치는 변수인 온도(40~100℃)와 마이크로웨이브 조사 강도(600~1,600 W)를 독립 변수로 하여(조사 시간은 3분으로 고정) 단백질 제거효율의 최적 조건을 찾는 실험을 진행하였다(Table 1). 본 연구는 온도와 마이크로웨이브 조사 강도를 변수로 한 2인자 설계를 하여 9개의 실험점과 중앙점(70℃, 1,100 W)을 5회 반복하여 총 13개의 실험을 진행하였다[19,21]. 실험설계 및 분석은 통계프로그램(Minitab Inc. Release15)을 사용하였고 반응표면분석법을 통해 해석된 결과는 분산분석(analysis of variance, ANOVA)을 통해 유의성을 확인하였다.

2.4. ME-키틴 분석방법

2.4.1. Fourier transform infrared spectroscopy

추출된 키틴 샘플의 α-키틴 구조 확인을 위한 흡수 스펙트럼은 Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) (Nicolet iS50, Thermo Scientific, 미국)을 사용해 측정되었다. 다이아몬드 크리스탈 부착물을 사용한 attenuated total reflectance 분석을 진행했으며 32회 스캔(scan) 내에서 4cm^-1의 분광분해능으로 400~4,000cm^-1 범위에서 분석하였다[22].

2.4.2. X-선 회절 분석

결정화도(crystallinity index, CrI)란 물질이나 물체가 결정 구조에서 원자나 분자가 규칙적으로 배열된 정도를 말하고, 결정화도가 높을수록 새우껍질에서 단백질과 미네랄의 제거율이 높음을 의미한다[23]. 키틴의 결정화도는 X-ray diffractometer (XRD) (D8 Discover +, Bruker AXS GmbH, 독일)를 사용하여 측정하였다. 각도(2θ)는 5o와 55o사이에서 분석한다. 키틴 결정구조에서 110면(plane)에 해당하는 회절 피크의 강도는 일반적으로 2θ≅20o부근에서 관찰되며, 키틴의 결정성 영역을 대표한다[24]. 구해진 회절 강도(intensity, I)로 결정화도를 계산한다(식 4) [10].

(4)

CrI = [(I110 - Iam)/I110] × 100

여기서, I_am은 2θ≅16o에서의 비정질(amorphous) 회절 세기이며, I₁₁₀은 2θ≅20o에서 최대 강도이다.

2.4.3. Scanning electron microscopy

새우껍질과 키틴 샘플의 측정은 scanning electron microscopy (SEM)(S-4800, Hitachi, 일본)으로 측정하였다. SEM을 통해 기존 새우껍질 가루와 ME-키틴의 표면의 형태를 분석하였다[5].

3. 결과 및 고찰

3.1. 미네랄 제거

키틴으로부터 키토산 등 고품질 생산품을 얻기 위해서는 미네랄 제거 과정에서 회분함량 1% 미만으로 제거하는 것이 필수적이다[25].

3.1.1. 조사 시간

마이크로웨이브 조사 시간이 미네랄 제거율에 미치는 영향을 보기 위하여 조사 강도(1,000 W)와 온도(100℃)의 조건을 고정하고 1~5분 범위에서 진행하였다(Fig. 1(a)). 미네랄 제거율은 1분에서 가장 낮았고(97.0%), 3분에서 99.0%, 4분에서 99.2%로 조사 시간이 증가할수록 제거율이 증가했지만, 5분에서는 제거율이 감소하였다. 기존 문헌에서는 HCl 농도(3 M)와 가정용 마이크로웨이브 조사 강도(650 W)가 고정된 조건에서 조사 시간(2~10분)이 4분까지는 증가할수록 미네랄 제거율이 96.0%까지 증가하지만, 그 이후에는 제거율이 일정하게 유지되었다[10]. 언급한 문헌과 비교해 보면 본 실험의 미네랄 제거율이 더 높았다(99.2%). 즉, 조사 시간 3분에서 회분함량이 0.97%로 본 연구에서 제시하고 있는 실험 방법이 고품질 키틴 생산에 적합한 것을 알 수 있다[25].

3.1.2. 온도

마이크로웨이브 조사 온도가 미네랄 제거율에 미치는 영향을 보기 위하여 조사 강도(1,000 W)와 조사 시간(3분)의 조건을 고정하고 90~130℃ 범위에서 진행하였다(Fig. 1(b)). 온도가 100℃에서 99.0%로 미네랄 제거율이 가장 높았다. 즉, 90~100℃까지는 제거율이 증가하고 100℃이상에서는 제거율이 감소하였다. 다른 문헌에서는 기존의 가열 방법을 이용하여 HCl 농도(1.1M)와 가열 시간(60분)이 고정된 조건에서 온도(30~60℃)가 증가할수록 제거율이 증가하여 최대 94.6% 미네랄 제거율을 보였다[26]. 본 연구에서는 기존의 가열 방법보다 높은 온도(100℃)와 짧은 조사 시간(3분) 조건을 통해 높은 제거율을 보여주었다. 이를 통해 마이크로웨이브 보조 추출 방법이 새우껍질의 미네랄 제거에 더 효과적임을 알 수 있다.

3.1.3. 조사 강도

마이크로웨이브 조사 강도가 미네랄 제거율에 미치는 영향을 보기 위하여 조사 시간(3분)과 온도(100℃)의 조건을 고정하고 400~1,600 W 범위에서 진행하였다(Fig. 1(c)). 조사 강도가 1,000 W일 때 제거율이 99.0%에 도달한 후 1,600 W에서 99.9%이상으로 나타나 조사 강도가 증가할수록 미네랄 제거율이 증가하는 경향을 보였다. 문헌에서도 HCl 농도(3 M)를 고정한 조건에서 조사 시간(2~10분)에 관계없이 마이크로웨이브 조사 강도(90~650W)가 증가할수록 미네랄 제거율이 증가한다고 보고하고 있다[10].

3.2. 단백질 제거

미네랄 제거 실험에서 도출한 인자별 최적점인 조사 시간 3분, 온도 100℃, 조사 강도 1,600 W으로 고정하여 단백질 제거 실험을 진행하였다.

3.2.1. 조사 시간

조사 시간이 단백질 제거율에 미치는 영향을 보기 위하여 조사 온도(100℃)와 조사 강도(1,000 W)의 조건을 고정하고 1~10분 범위에서 진행하였다(Fig. 2(a)). 단백질 제거율이 조사 시간 1분(41.1%)에서 가장 낮았고 10분에서 95.0%로 최고점을 보여 조사 시간이 증가할수록 제거율이 증가하였다. 다른 문헌에서도 NaOH 농도(5%)와 가정용 마이크로웨이브 조사 강도(650 W)를 고정한 조건에서 조사 시간(2~10분)이 증가할수록 단백질 제거율이 증가하다가 95.0%에 도달한 후 일정하게 유지되었다[10].

3.2.2. 온도

온도가 단백질 제거율에 미치는 영향을 보기 위하여 조사 강도(1,000 W)와 조사 시간(3분)의 조건을 고정하고 40~ 120℃ 범위에서 진행하였다(Fig. 2(b)). 제거율은 40℃에서 88.5%로 가장 높았고, 120℃(80.0%)에서 최저로 나타나 온도가 증가할수록 제거율이 감소하였다. 다른 문헌에서는 기존의 가열 방식으로 NaOH 농도(2.5 M)와 가열 시간(360분)이 고정된 조건에서 온도(25~100℃)의 경우 약 75℃에서 제거율 95.0%에 도달하고 이후 증가할수록 제거율이 감소하였다[27]. 본 연구에서 MARS 5의 설정 온도는 실제 실험 중 측정 온도와 18~29℃ 정도 차이가 났다. 이와 같이 온도 차이가 난 이유는 알칼리성 용액 NaOH로 단백질을 가수분해하는 과정에서 OH^-이온이 단백질의 펩타이드 결합을 끊어주며 이때 발열반응이 발생할 수 있기 때문이다[28,29]. 또한 물에 용해된 NaOH 용액이 Na⁺와 OH^-이온으로 물 분자와 결합하여 수화하는 과정에서 에너지를 방출하는 발열 반응이 발생할 수 있다[30]. 따라서 본 연구의 MARS 5 설정 온도와 기존 문헌의 단백질 제거 시 온도는 차이가 있었지만, 측정 온도와의 차이는 크지 않았다. 추가로 일반적으로 60~70℃에서 단백질의 열변성이 일어나며 이로 인해 단백질의 구조가 파괴되기 시작한다. 이때 NaOH와 같은 알칼리성 용액이 단백질의 결합을 분해한다[31,32]. 그러나 70℃ 이상의 높은 온도에서는 단백질이 심하게 변성되어 불용성 응집체를 형성할 수도 있다. 이는 단백질이 용액에서 분리되기 어려워지게 만들어 온도가 증가할수록 제거율이 떨어지게 된다[33].

3.2.3 조사 강도

조사 강도가 단백질 제거율에 미치는 영향을 보기 위하여 조사 온도(40℃)와 조사 시간(3분)의 조건을 고정하고 400-1,600 W 범위에서 진행하였다(Fig. 2(c)). 조사 강도는 400 W(84.7%)에서 가장 낮았고, 1,600 W에서 94.9%로 가장 높아 조사 강도가 증가할수록 단백질 제거율이 증가하였다. 다른 연구에서도 NaOH 농도(5%)를 고정한 조건에서 조사 시간(2~10분)에 관계없이 마이크로웨이브 조사 강도(90~650 W)가 증가할수록 단백질 제거율이 증가하였다[10]. 이는 마이크로웨이브 조사 강도가 증가할수록 단백질 구조의 변성을 많이 일으켜 새우껍질의 단백질 분리에 용이하기 때문이다[34].

3.3. 면 중심 합성 설계

면 중심 합성 설계에 의해 진행된 실험 결과, 분산분석(analysis of variance, ANOVA)을 통해 마이크로웨이브의 온도와 조사 강도의 p값은 모두 0.001이하로 단백질 제거에 유의미한 영향을 끼친다는 사실을 알 수 있다(Table 2). 적합성 결여 p값은 0.105(p>0.05)이므로 모델이 적합하다는 것을 알 수 있다. 결정계수 R²값의 범위는 0≤R²≤1이고 R²이 1에 가까울수록 정확히 예측 가능한 모델이다[19]. 이에 본 실험에서 R²가 0.98로 예측 가능성이 높은 모델이 도출되었다고 할 수 있다. 최적화 결과는 온도 40℃, 마이크로웨이브 조사 강도 1,600 W 일 때 단백질 제거율이 95.0%이다. 마이크로웨이브의 조사 강도가 증가하고 온도가 낮아질수록 단백질 제거율이 증가하였다(식 5)(Fig. 3).

(5)

Protein removal (%) = 80.50-0.0199X1+0.01779X2- 0.000939X12-0.000005X22-0.000006 X1X2

여기서, X₁은 온도, X₂는 마이크로웨이브 조사 강도이다.

3.4. ME-키틴의 특성

3.4.1. Fourier transform infrared spectroscopy

FTIR 분석 결과, O-H 신축은 ME-키틴 3,437 cm^-1, 상업용 키틴 3,434 cm^-1에서, N-H 신축은 ME-키틴 3,101 cm¹, 상업용 키틴은 3,101 cm^-1에서 관찰되었다(Table 3, Fig. 4) [5]. ME-키틴과 상업용 키틴 모두 C-H 신축 범위인 2,900~2,800 cm^-1피크를 가졌다. ME-키틴은 1,655 cm^-1과 1,620 cm^-1에서 피크를 보였고, 상업용 키틴은 1,654 cm^-1과 1,620 cm^-1에서 피크를 나타냈으며, 이는 C=O 신축에 의한 것으로, 이는 아미드 I 영역에서(1,700~1,600 cm^-1) –CO⋯HN 및 –CO⋯HOCH₂ 간의 분자간 수소 결합의 발생과 관련이 있는 것으로 추정된다[35,36]. ME-키틴 1,552 cm^-1과 상업용 키틴 1,553 cm^-1에서 관찰되는 피크는 C-N 신축과 N-H 굽힘의 조합인 아미드 II 영역(1,700~1,600 cm^-1)과 관련이 있다[5,35]. ME-키틴과 상업용 키틴 1,376 cm^-1에서 나타난 피크는 키틴의 아세트 아미드 그룹에 해당된다[36]. 895 cm^-1에서의 특정 피크는 β-1,4 글리코시드 결합을 나타낸다[36]. 따라서 FTIR 피크의 결과, 마이크로웨이브 보조 추출 방법을 사용한 ME-키틴과 기존 화학처리 추출 방법을 사용한 상업용 키틴의 구조가 일치하며 ME-키틴이 α-키틴임을 확인할 수 있다[5].

3.4.2. X-선 회절 분석

새우 껍질의 XRD로 분석해 보면 3개의 특징적인 회절 피크(2θ=8.9o, 19.9o, 29.5o)를 갖는다(Fig. 5(a)). 새우껍질에서의 피크가 약 29o로 나타나는 것은 새우 껍질내에 포함된 탄산칼슘 때문인 것으로 보인다[37]. 2θ=29.5o의 회절 피크는 탄산칼슘에 해당된다[37]. 상업용 키틴과 ME-키틴에서는 6개의 특징적인 회절 피크(2θ=9.2o, 12.6o, 19.2o, 20.6o, 23.2o, 26.2o)를 관찰할 수 있었다(Fig. 5(b)). 이러한 피크는 여러 논문에서 측정된 α-키틴의 회절 피크와 동일한 것을 알 수 있다[38-40]. N-아세틸-D-글루코사민은 2θ=9o, N-글루코사민은 2θ=19o 주위의 피크에서 검출된다[37]. 새우껍질에서는 탄산칼슘이 검출되었지만 상업용 키틴과 ME-키틴에서는 검출되지 않았다. 결정화 지수는 새우 껍질 35.4%, 상업용 키틴 82.1%, ME-키틴 84.5%로 계산되었다. 이는 ME-키틴의 결정화도가 상업용 키틴보다 크므로 ME-키틴의 분자가 더 규칙적으로 배열되었고 불순물이 적음을 알 수 있다. 즉, 본 연구에서 사용한 마이크로웨이브 보조 추출 방법은 새우껍질에서 탄산칼슘과 단백질 제거에 효과적임을 알 수 있다[41].

3.4.3. Scanning electron microscopy

새우껍질 표면을 SEM으로 분석해 보면 약간의 기공이 있고, 미네랄과 단백질로 추정되는 물질의 부착으로 거친 표면이 관찰된다(Fig. 6(a), (b)) [39]. ME-키틴(Fig. 6(c), (d), (e)) 표면에서는 새우껍질과 비교해 다공성이 증가했으며 매끄러운 표면을 가진다[36]. 이는 ME-키틴이 미네랄 제거와 단백질 제거 과정에서 대부분의 미네랄과 단백질이 제거된 것으로 추정된다.

3.5. 실험의 한계 및 향후 연구

본 연구에서는 마이크로웨이브 조사 시간, 온도, 조사 강도 등의 조건에서 실험을 진행하였다. 하지만 본 연구에서 가장 낮은 온도인 40℃에서 단백질 제거율이 가장 높은 것에 대한 이유는 명확히 규명되지 않았다. 이에 마이크로웨이브를 활용한 단백질 제거 과정에서의 온도와 단백질 제거율 관계에 대한 추가적인 연구가 필요하다. 또한, 키토산은 항균 작용과 생분해성 및 안전성을 갖춘 생체 고분자로 다양한 산업 분야(식품, 의약품 등)에서 사용되므로 바이오 소재로서 가치를 높이기 위해 마이크로웨이브를 이용하여 고품질의 키토산 추출 최적화 연구가 필요하다[7].

4. 결 론

본 연구는 마이크로웨이브 보조 추출 방법을 이용하여 새우껍질에서 키틴을 추출하는 과정에서 조사 시간, 온도, 조사 강도 등이 미네랄 및 단백질 제거율에 미치는 영향을 알아보는데 성공하였다. 미네랄 제거 실험 결과, 조사 시간 3분, 온도 100℃, 조사 강도 1,600 W에서 99.9% 이상의 높은 미네랄 제거율을 달성하였다. 단백질 제거 실험에서는 온도가 낮을수록, 조사 시간과 조사 강도가 증가할수록 제거율이 높았다. 이러한 실험 결과를 바탕으로 면 중심 합성 설계를 진행한 결과, 단백질 제거의 최적 조건은 온도 40℃, 마이크로웨이브 조사 강도 1,600 W이며, 이때의 단백질 제거 효율은 95.0%였다. 마이크로웨이브 보조 추출 방법으로 얻은 ME-키틴은 α-키틴 구조를 가지고 결정화도가 높았다. 따라서 마이크로웨이브 보조 추출 방법으로 새우껍질에서 키틴을 효율적으로 추출할 수 있음을 알 수 있다.

Notes

Acknowledgement

본 연구는 2024년도 교육부의 재원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 지자체-대학 협력기반 지역혁신 사업의 결과입니다(2022RIS-005).

Declaration of Competing Interest

The authors declare that they have no known competing financial interests or personal relationships that could have appeared to influence the work reported in this paper.

Fig. 1.

Removal efficiency of mineral in microwave heating based on (a) reaction time, (b) temperature, and (c) microwave power.

Fig. 2.

Removal efficiency of protein in microwave heating based on (a) reaction time, (b) temperature, and (c) microwave power.

Fig. 3.

A three-dimensional mesh graph representing independent variables affecting the removal efficiency of protein.

Fig. 4.

Comparison of Fourier transform infrared spectroscopy spectra of commercial and microwave-assisted extraction method chitin samples.

Fig. 5.

Comparison of X-ray diffraction patterns of the (a) shrimp shell and (b) commercial and microwaveassisted extraction method chitin samples.

Fig. 6.

Scanning electron microscopy images of (a) shrimp shell at 500× magnification, (b) shrimp shell at 5,000× magnification, (c) ME-chitin at 500× magnification, (d) ME-chitin at 3,000× magnification, and (e) ME-chitin at 12,000× magnification.

Table 1.

Independent variable and experimental design by central composite face-centered design.

Run no.	Independent variable		Removal (%)
Run no.	Temperature (℃)	Power (W)	Removal (%)
1	70	600	83.0
2	40	1,600	95.0
3	100	600	78.2
4	40	1,100	91.4
5a)	70	1,100	88.5±0.2
6	100	1,100	81.7
7	70	1,100	88.4
8	70	1,100	88.4
9	40	600	87,0
10	70	1,100	88.8
11	70	1,100	88.3
12	100	1,600	85.0
13	70	1,600	88.6

^a) The center point was repeated 5 times.

Table 2.

Analysis of variance for central composite face-centered design.

Source	DF^a)	Adj SS^b)	Adj MS^c)	F-value	P-value
Model	5	223.465	44.693	93.58	0.000
Linear	2	214.508	107.254	224.56	0.000
Temp	1	134.427	134.427	281.45	0.000
Power	1	80.081	80.081	167.67	0.000
Square	2	8.927	4.464	9.35	0.011
Temp × Temp	1	1.973	1.973	4.13	0.082
Power × Power	1	3.622	3.622	7.58	0.028
2-Way Interaction	1	0.031	0.031	0.06	0.807
Temp × Power	1	0.031	0.031	0.06	0.807
Error	7	3.343	0.478
Lack-of-fit	3	2.517	0.839	4.06	0.105
Pure Error	4	0.826	0.206
Total	12	226.809

^a) Degrees of freedom

^b) Adjusted sum of squares

^c) Adjusted mean squared

Table 3.

Assignment of the relevant band of Fourier transform infrared spectroscopy spectra of commercial and microwave-assisted extraction method chitin samples.

Vibration modes	Wavenumber (cm^-1)
Vibration modes	CC^a)	ME-chitin^b)
OH stretching	3,434	3,437
NH stretching	3,101	3,101
Asymmetric CH₃ stretching	2,960	2,961
Symmetric CH₃ stretching and asymmetric CH₂ stretching	2,933	2,933
Symmetric CH₃ stretching and asymmetric CH₂ stretching	2,877	2,876
C=O secondary amide stretch (amide I)	1,654	1,655
C=O secondary amide stretch	1,620	1,620
NH bend, CN stretch	1,553	1,552
CH₂ bending and CH₃ deformation	1,415	1,416
CH₂ bending and CH₃ symmetric deformation	1,376	1,376
CH₂ wagging	1,308	1,307
Asymmetric bridge oxygen stretching	1,154	1,154
Asymmetric in-phase ring stretching	1,113	1,114
C-O-C asymmetric stretch in phase stretching	1,068	1,068
C-O asymmetric stretch in phase stretching	1,009	1,008
CH₃ wagging (along the chain)	952	952
CH₃ stretching (saccharide rings) β bond	895	895

^a) CC: Commercial chitin

^b) ME-chitin: Microwave-assisted extraction method chitin

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