Improvement of Anaerobic Digestion by Addition of Halloysite and Magnetite Powders

Heo, Jae Pil; Bae, Ilho; Shin, Juhee; Lee, Myoung-Eun; Lee, Younki; Triolo, Jin Mi; Shin, Seung Gu

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J Korean Soc Environ Eng > Volume 46(11); 2024 > Article

할로이사이트 및 자철석 분말 투입을 통한 혐기성 소화 개선 효과 조사

Research Paper

Journal of Korean Society of Environmental Engineers 2024; 46(11): 725-739.

Published online: November 30, 2024

DOI: https://doi.org/10.4491/KSEE.2024.46.11.725

할로이사이트 및 자철석 분말 투입을 통한 혐기성 소화 개선 효과 조사

허재필¹

, 배일호²

, 신주희³

, 이명은³

, 이윤기⁴

, 박진미^2,^‡

, 신승구^1,^2,^3,^†

¹경상국립대학교 에너지공학과

²경상국립대학교 에너지시스템공학과

³경상국립대학교 미래융복합기술연구소

⁴경상국립대학교 나노신소재융합공학과

Improvement of Anaerobic Digestion by Addition of Halloysite and Magnetite Powders

Jae Pil Heo¹

, Ilho Bae²

, Juhee Shin³

, Myoung-Eun Lee³

, Younki Lee⁴

, Jin Mi Triolo^2,^‡

, Seung Gu Shin^1,^2,^3,^†

¹Department of Energy Engineering, Gyeongsang National University

²Department of Energy System Engineering, Gyeongsang National University

³Future Convergence Technology Research Institute, Gyeongsang National University

⁴Department of Materials Engineering and Convergence Technology, Gyeongsang National University

^† Corresponding author E-mail: sgshin@gnu.ac.kr Tel: 055-772-3887 Fax: 055-772-3889

^‡ Corresponding author E-mail: jinmitriolo@gnu.ac.kr Tel: 055-772-3880 Fax: 055-772-3889

Received September 22, 2024 Revised October 25, 2024 Accepted November 11, 2024

Abstract

Objectives

This study aimed to explore the potential of halloysite and magnetite powders to enhance anaerobic digestion efficiency and to compare their effects.

Methods

Anaerobic digestion experiments were conducted in a total of four consecutive batch processes using reactors with halloysite and magnetite powders added at concentrations of 1 g/L, 10 g/L, and 50 g/L, as well as a control reactor without any powder addition. Cumulative methane production was measured in each batch, and the Gompertz model was applied to calculate kinetic parameters, which were then compared with the control. Additionally, microbial community analysis was performed using 16S rRNA amplicon sequencing, and correlations between the powder concentrations, Gompertz kinetic parameters, and microbial groups were evaluated.

Results and Discussion

Both powders demonstrated an effect on improving methane production rates. When halloysite was added at a concentration of 50 g/L, an increase in methane production rate was observed in all batches. Compared to the control, the lag phase (λ) was reduced by up to 31.4%, and the maximum methane production rate (R_m) increased by 17.6%. While the effects of halloysite at concentrations of 1 g/L and 10 g/L were less significant compared to 50 g/L, trends of reduced lag phase and increased R_m were noted in at least two batches. For magnetite powder, the most effective concentration in the first and second batches was 1 g/L, but in the third and fourth batches, lag phase (λ) was reduced by up to 39.3%, and the maximum methane production rate (R_m) increased by 13.2% at concentrations of 10 g/L and 50 g/L. Microbial community analysis revealed an increased dominance of Geobacter and Methanosarcina associated with the DIET mechanism as the amount of magnetite increased.

Conclusion

This study confirms the potential of halloysite and magnetite powders to enhance methane production rates in anaerobic digestion processes. These findings suggest the feasibility of using powdered additives to improve the efficiency of anaerobic digestion, providing foundational data for future related research.

Key words: anaerobic digestion, halloysite, magnetite, powdered additive, microbial community

요약

목적

할로이사이트 및 자철석 분말이 혐기성 소화 효율을 향상시킬 수 있는 가능성을 탐구하고, 이들의 효과를 비교하였다.

방법

할로이사이트와 자철석 분말을 각각 1 g/L, 10 g/L, 50 g/L 농도로 투입한 반응조와 아무 분말도 투입하지 않은 대조군 반응조를 설정하여 총 4회의 연속 회분식 혐기성 소화 실험을 수행하였다. 각 배치에서 누적 메탄 생성량을 측정하고, Gompertz 모델링을 적용하여 파라미터 값을 산출하였으며, 대조군과 비교하였다. 또한, 16S rRNA amplicon 염기서열 분석을 통해 각 반응조의 미생물 군집을 분석하고, 두 분말의 농도 및 Gompertz 동역학 변수와 미생물 그룹 간의 상관관계를 평가하였다.

결과 및 토의

두 분말 모두 메탄 생성 속도를 개선하는 효과가 나타났다. 할로이사이트를 50 g/L 투입한 경우, 모든 배치에서 메탄 생성 속도의 증가가 확인되었으며, 대조군과 비교했을 때 지연 기간(λ)은 최대 31.4%, 최대 메탄 생성 속도(R_m)는 17.6%까지 증가했다. 1 g/L와 10 g/L 농도로 투입했을 경우에는 50 g/L에 비해 효과가 작았지만, 최소 두 번의 배치에서 지연 기간 단축과 R_m 증가 경향이 나타났다. 자철석 분말의 경우, 1차와 2차 배치에서는 1 g/L 투입이 가장 효과적이었으나, 3차와 4차 배치에서는 10 g/L 및 50 g/L 농도에서 지연 기간(λ)이 최대 39.3% 단축되고, 최대 메탄 생성 속도(R_m)는 13.2%까지 증가하는 결과를 보였다. 미생물 군집 분석에서는 자철석 투입량이 증가함에 따라 DIET 메커니즘에 관여하는 Geobacter와 Methanosarcina의 우점화가 확인되었다.

결론

할로이사이트와 자철석 분말이 혐기성 소화 공정의 메탄 생성 속도를 향상시킬 수 있는 잠재력을 가지고 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 혐기성 소화 공정의 효율성을 높이기 위한 분말 제제의 활용 가능성을 제시하며, 향후 관련 연구를 위한 기초 데이터를 제공할 것이다.

주제어: 혐기성 소화, 할로이사이트, 자철석, 분말 제제, 미생물 군집

1. 서 론

혐기성 소화(anaerobic digestion; AD)는 미생물을 이용해 유기성 폐기물을 분해하고 메탄과 이산화탄소, 즉 바이오가스를 생산하는 생물학적 처리 공정이다. 이 과정은 산소가 없는 상태에서 진행되기 때문에 호기 반응에 비해 반응 시간이 느리고, 메탄생성균(methanogens)의 생장 조건을 맞추기 위해 유기산 및 암모니아 농도를 조절해야 하는 등 까다로운 점이 있다. 따라서, 공업화하기 위해서는 반응조 내의 수분 함량, 온도, pH, 미생물 체류 시간, 교반 등의 환경 조건을 적절하게 유지하는 것이 필요하다[1]. 혐기성 소화는 음식물류 폐기물, 하수슬러지, 가축분뇨뿐만 아니라 농업 폐기물이나 공장 폐수 등 다양한 유기성 폐기물을 처리하여 유용한 메탄 가스를 얻는 환경 친화적이고 지속 가능한 폐기물 처리 방법으로 주목 받고 있다.

이러한 전통적인 혐기성 소화 공정과 더불어, 최근에는 유기성 폐기물의 처리 성능과 에너지 회수 효율을 향상시키기 위해 생물 촉매 전기화학 공정(bioelectrochemical systems; BES)이 대두되었다[2,3]. BES는 신세대 바이오 기반 기술로서, 유기물의 분해를 통해 전기, 수소, 알코올, 휘발성 지방산 등 다양한 부가가치를 창출할 수 있는 잠재력을 지닌 시스템을 통칭한다. 특히 이 중 대표적인 공정으로는 유기물로부터 전기를 생산하는 미생물 연료 전지(microbial fuel cells; MFC)와 유기물로부터 수소를 생산하는 미생물 전기분해 전지(microbial electrolysis cells; MEC)가 있다[2,3].

한편, 혐기성 소화의 안정성 및 효율성을 높이기 위해 다양한 전략이 사용될 수 있다. 이러한 전략에는 기질의 병합 소화, 난분해성 기질의 전처리, 반응기 설계 개선, 운전 조건 최적화, 그리고 유기성 및 무기성 제제의 첨가 등이 포함된다[4]. 유기성 제제로는 미생물제와 효소 등의 생화학적 물질이 있으며, 무기성 제제로는 영가(zerovalent) 금속, 금속 산화물, 탄소 기반 물질, 점토 광물, 다중 화합물(multi-compound) 등이 있다[5-7].

혐기소화를 촉진한다고 알려진 대표적인 무기성 제제는 전기 전도성(10²~10³ Ω^-1cm^-1)을 가진 자철석(magnetite, Fe₃O₄)이다. 자철석은 직접 종간 전자 전달(direct interspecies electron transfer; DIET)을 촉진하는 물질로 활발히 연구되고 있다[8-10]. DIET는 전도성 물질을 통해 특정 미생물 종간에 전자를 직접 교환하는 과정을 의미하며, 이는 수소(H₂)나 포름산(formate)과 같은 중간 물질 없이 전자를 전달하여 메탄 생성 효율을 높인다[9-11]. 간접 종간 전자 전달(indirect interspecies electron transfer; IIET)은 H₂ 및 포름산의 합성과 소비에 복잡한 반응이 필요하지만[12], DIET는 직접 전자를 전달하므로 IIET보다 열역학적으로 유리하다[13], 수학적 모델링 연구에서는 DIET의 세포 간 전자 전달 속도가 H₂를 통한 IIET보다 최대 8배 이상 빠를 수 있다고 보고하였다[14].

DIET는 생물학적 및 비생물학적 전도성 물질을 통해 이루어질 수 있다(Fig. 1). 생물학적 전도성 물질(biotic conductive materials)로는 전도성 필리(electrically conductive pili; e-pili)가 있으며, 이 생물학적 나노와이어(nanowire)는 미생물의 세포 외부로 돌출되어 다른 미생물이나 전도성 물질과 전자 교환을 가능하게 한다. 또 다른 생물학적 메커니즘으로는 미생물 세포 막에 위치하는 cytochrome c와 같은 전자 전달 단백질이 있다(Fig. 1(A)). 비생물학적 전도성 물질(abiotic conductive materials)은 미생물 간의 물리적 다리를 형성하여 전자를 전달하는데, 자철석, 그래핀, 탄소 나노튜브 등이 그 예이다[15] (Fig. 1(B)).

많은 연구에서 회분식 및 연속식 혐기소화 실험을 통해 자철석을 투입이 메탄 생성을 촉진한다고 보고하였다[9,10,16,17]. 이는 전자를 제공하는 박테리아 그룹과 전자를 수용하여 메탄을 생성하는 고세균 간의 DIET 기작이 활성화되어 나타나는 효과로 알려져 있다. Geobacter와 Syntrophomonas 같은 박테리아는 유기물이나 다른 기질을 분해하여 전자를 방출하고, 전도성 필리와 같은 구조를 통해 전자를 전달할 수 있다. Methanosarcina, Methanothrix (Methanosaeta), Methanospirillum, Methanobacterium과 같은 메탄생성균은 이러한 박테리아로부터 직접 전자를 전달받아 효율적으로 메탄을 생성한다[18-20].

혐기소화조 성능을 향상시키기 위해 투입되는 무기성 제제에는 자철석과 같은 전도성 물질뿐만 아니라, 점토 광물도 포함된다. 점토(clay)는 주로 규산염 광물로 구성된 비금속 무기물질로, 일반적으로 2 μm 이하의 크기를 가지며, 이는 점토가 물과 혼합될 때 유연성과 가소성을 부여한다. 또한, 점토는 나노스케일 조직을 가지고 있어 높은 표면적을 제공하며, 이는 화학적 반응성과 흡착 능력을 향상시킨다. 점토는 생체 적합성이 입증된 천연 재료로서 의료 및 제약 분야에서도 활용되며, 저렴한 가격과 풍부한 매장량으로 인해 경제적으로도 유리한 재료이다. 이러한 특성 덕분에 점토는 도자기, 건축 자재, 화장품, 제지 산업 등 다양한 분야에서 광범위하게 사용된다[21,22].

점토 광물 중 할로이사이트(Al₂Si₂O₅(OH)₄∙nH₂O)는 나노튜브 형태의 독특한 구조를 갖는데, 이로 인해 종종 할로이사이트 나노튜브(halloysite nanotube; HNT)라고 불린다(Fig. 2). 해당 구조는 음전하를 띠는 이산화규소 외층과 양전하를 띠는 알루미놀 내층 사이에 결합 불균형으로 인해 튜브 형태로 말리면서 생기는데, 이때 메조 기공 영역(2~50 nm)의 빈 공간 (inner cavity)을 형성하게 된다. 나노튜브의 길이는 수에서 수십 마이크로미터에 이르며, 높은 표면적과 내부 빈 공간을 제공하여 다양한 화학적 및 생물학적 물질을 흡착하고 저장할 수 있다[21,23,24]. 특히, 이 공간에 효소나 약물을 효과적으로 캡슐화하고, 필요에 따라 방출하는 연구들이 생물학 분야에서 이뤄지고 있다[23].

벤토나이트, 활석, 버미큘라이트 등 다양한 점토 광물을 각각의 반응조에 투입한 회분식 혐기소화 연구에서, 점토 광물을 첨가한 모든 경우 대조군에 비해 공정 초기 단계(startup)가 촉진되었다고 보고되었다[25]. 또한, 혐기 반응조에 벤토나이트를 투입하면 메탄 수율 증가 및 지연 기간 단축 효과가 있으며[7], 카올린 및 할로이사이트를 투입할 때도 메탄 수율이 증가된다는 보고가 있다[26,27]. 이러한 개선 효과는 점토 광물이 가진 높은 흡착력이 혐기소화에 저해가 되는 물질을 흡착하거나[7], 이들이 가지고 있는 유효 물질(이온 등)을 서서히 소화액에 공급하는 효과에서 기인할 것으로 제시되고 있다[25,28]. 그러나 혐기 반응조에서 점토 광물의 효과를 보고한 연구는 제한적이며, 관련 기작은 명확히 제시되지 않고 있다.

본 연구는 할로이사이트 및 자철석 분말이 혐기성 소화 과정에 미치는 영향을 평가하였다. 이를 위해 두 분말을 각각 농도별(1, 10, 50 g/L)로 투입하여 연속 회분식 혐기성 소화 실험을 수행하고, 기질의 유기물 함량 변화 및 메탄 생성량을 측정하였다. 배양 시간에 따른 누적 메탄 생성량을 modified Gompertz 모델에 적용하여 메탄 생성 공정의 동역학적 특성을 나타내는 주요 변수들을 산출하고 비교하였다. 또한, 16S rRNA amplicon 시퀀싱을 통해 박테리아와 고세균 군집을 분석하여 두 분말의 투입 농도 및 Gompertz 동역학 변수와 미생물 그룹 간의 상관관계를 평가하였다. 이 연구는 혐기성 소화 공정의 효율성 향상을 위한 분말 첨가제의 활용 가능성을 제시하며, 향후 관련 연구를 위한 기초 데이터를 제공할 것이다.

2. 실험방법

2.1. 실험 재료

본 연구에서 사용한 접종원과 기질은 기존에 보고된 도계장 유래 폐기물의 생화학적 메탄 잠재량(biochemical methane potential; BMP) 평가 논문에서 사용된 것과 동일한 것이다[29]. 즉, 접종원으로는 Y시 바이오가스화 시설(음식물류 폐기물과 축산분뇨를 병합소화)에서 채취한 혐기성 슬러지를 입자 크기 0.85 mm의 체로 걸러낸 후, 약 2주간 35°C 항온실에서 기질 투입 없이 배양하여 잔류 유기물을 제거한 후 사용하였다. 기질로는 S시 소재 도계장 내 수처리 설비에서 발생한 탈수케이크(sludge cake)를 사용하였다. 탈수케이크는 1차 배치 실험을 위해 냉장 보관 후 사용하였으며, 2차 배치부터는 냉동 보관된 것을 사용하여 실험 시마다 한 번의 냉동-해동 과정이 추가되었다. 탈수케이크는 물과 1:3(1차 배치) 또는 1:1 (2~4차 배치)의 부피비로 혼합한 후 가정용 믹서기로 분쇄하여 혐기성 반응조의 기질로 준비하였다. 여기에 할로이사이트(PB급, 풍산광업㈜, 경상남도 산청)30) 분말 또는 자철석 분말(iron (II, III) oxide nanoparticle, 입자 크기 50~100 nm, Sigma- Aldrich)을 농도별로 투입하여 메탄 생성 반응에 미치는 영향을 분석하였다. 할로이사이트 분말은 5~6 g씩 도가니에 넣어 550°C에서 40분 동안 잔류 유기물을 연소시킨 뒤 사용하였다.

2.2 회분식 혐기성 소화 실험

할로이사이트 또는 자철석 분말의 투입 용량은 1.0, 10, 50 g/L로 설정하였다. 분말을 투입하지 않은 대조군을 포함하여 7개 조건에서 동일한 반응조를 2기씩 사용하여 4회차에 걸쳐 총 170일간 연속 회분식(serial batch) 실험을 수행하였다. 단, 1차 배치에서는 기질 없이 접종원만 투입한 반응조를 동일한 조건에서 배양하여 접종원 유래 메탄 발생량을 측정하였다. 반응조는 250 mL 용량의 세럼 바틀(serum bottle)에 100 mL의 유효 부피로 설정하였으며, 모든 배치에서 기질의 초기 농도가 14.8 g COD/L가 되도록 동일한 양의 탈수케이크와 물을 넣어주었다. 1차 배치 시 접종원은 3.9 g VS/L로 투입하였다. 반응조는 부틸 고무마개와 알루미늄 캡으로 밀봉한 후, 헤드스페이스(head space)를 N₂가스로 치환하고 35°C 항온실에서 30분간 정치한 뒤 양압을 제거하였다. 반응 시작 후 초기 11일 동안은 매일 1회, 그 이후에는 1~5일 간격으로 바이오가스 발생량을 측정하였으며, 측정 후에는 반응조를 흔들어 혼합하였다. 가스량을 측정할 때는 전자기압계(LEO2, Keller)를 사용하여 항온실의 대기압을 확인한 후, 반응기의 압력이 대기압과 같아질 때까지 주사기로 바이오가스를 추출하여 그 부피를 기록하고 배출하였다. 바이오가스 내 메탄 및 이산화탄소 함량은 가스 분리 컬럼(CP7485, Agilent)과 열전도도 검출기(TCD)가 장착된 가스 크로마토그래프(GC-2030, Shimadzu)를 사용하여 2주마다 1회씩 측정하였다. 각 배치의 종료 시점은 일일 바이오가 스 생산량이 누적 바이오가스 생산량의 0.5% 미만일 때로 설정하였다. 각 배치의 종료 및 다음 배치의 시작 시점에는 반응조를 중력침강한 후 개봉하여, 전체 반응액의 13.5%를 상등액에서 제거하고, 남은 반응액을 현탁시켜 0.5%를 DNA 추출용으로 샘플링하였다. 이후, 제거된 부피만큼 기질을 보충하여 초기 기질 농도가 14.8 g COD/L로 동일하게 유지되도록 하였으며, 같은 절차로 실험을 진행하였다.

2.3. 분석 방법

총고형물 함량(total solids, TS) 및 휘발성 고형물 함량(volatile solids, VS) 측정은 미국공중보건협회(APHA)의 표준 시험법을 따랐으며, 화학적 산소 요구량(chemical oxygen demand, COD)은 Humas사의 수질 분석 키트를 사용하여 크롬(Cr)법으로 측정하였다. 용해성 COD(soluble COD; SCOD)는 시료를 pore size 0.45 μm 시린지 필터로 거른 뒤 여과액을 측정하였다. 에탄올 및 8종의 휘발성 지방산(C₂-C₆: 아세트산, 프로피온산, 아이소뷰티르산, 뷰티르산, 아이소발레르산, 발레르산, 아이소카프로산, 카프로산)의 농도는 유기산 분리 컬럼(113-3133, Agilent)과 불꽃이온화검출기(FID)가 장착된 가스 크로마토그래프(GC-2030, Shimadzu)를 사용하여 측정하였다.

2.4. 누적 메탄 생산량 계산 및 모델링

각 반응조에서 발생한 바이오가스 부피를 측정한 뒤, 누적 메탄 생산량을 구하기 위해 다음과 같은 순서로 계산하였다. 먼저, 변형된 Antoine 식 (1)을 통해 수증기압(P_vap)을 구하고[31], 식 (2)를 사용하여 수증기를 제외한 바이오가스 비율(V_dry)을 구하였다. 이 값을 측정된 바이오가스 부피(mL)에 곱하여 수증기를 뺀 바이오가스 부피(mL)를 구하였다. 바이오가스 부피 측정 시 기압은 1 atm (1013.25 mbar)으로 간주하였다.

(1) [31]

Pvap (mbar)=10(8.1962−(1730.63273.15+Tgas−39.724)

(2)

Vdry(%)=1013.25−Pvap1013.25

여기서, P_vap은 수증기압(mbar), T_gas는 배양 온도(35°C), V_dry는 수증기를 제외한 바이오가스 비율(%)이다.

이후 0°C, 1 atm의 표준 상태에서의 부피(N mL)로 변환하고, 가스 크로마토그래피를 통해 얻은 바이오가스(이산화탄소+메탄) 대비 메탄 함량 결과를 곱하여 메탄 발생량(N mL)을 구하였다. 2차 배치부터는 이전 배치에서 완전히 가스 발생이 종료된 후 기질을 투입하였고, 해당 회차에서 생성된 모든 바이오가스는 기질에서 유래했다고 가정하였다. 그러나 1차 배치에서는 접종원에서 유래한 메탄 발생량을 아래의 식 (3)을 통해 제외하였다.

(3)

반응조의 기질 유래 메탄 발생량(NmL) = 반응조의 메탄 발생량 (N mL)-반응조의 접종책에서 유래한 메탄발생량 (N mL)= 반응조의 메탄 발생량 (N mL) - ( 기질 미투입 반응조의 메탄 발생랑 (NmL) 기질 미투입 반응조에 투입된 접종액 양( mL inoculum) × 반응조에 투입된 접종액 양( (mL inoculum)

측정일마다의 기질 유래 메탄 발생량을 계산한 뒤, 이것을 누적하였고, 반응조에 투입된 기질의 유기물 함량(g COD)으로 나누어 최종적으로 배양 시간에 따른 기질 유기물 함량당 누적 메탄 발생량(N mL/g COD)를 산출하였다.

또한, 누적 메탄 생산 그래프를 식 (4)로 표현되는 modified Gompertz model에 적용하여 실험 데이터와 모델 예측치를 비교하였다[32].

(4)

Bt( mLCH4/gCOD)=BG×exp⁡[−exp⁡{Rm×e BG(λ−t)+1}]

여기서 B_t는 시간 t(days)에서의 누적 메탄 생산량, B_G는 최대 메탄 생성량, R_m은 최대 메탄 생산율(N mL/g VS/d), e는 자연상수, λ는 지연 기간(lag period; d)을 나타낸다.

2.5. Metagenomic sequencing 및 미생물 군집 분석

배치 종료 시점에서 채취한 현탁액을 동일 조건의 반응조끼리 동일한 부피로 혼합한 후, 이것을 50 μL씩 마이크로 튜브에 옮겨 15,000 g에서 5분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고, Bioneer사의 AccuPrep genomic DNA extraction kit을 사용하여 펠렛에서 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA에 존재하는 미생물 군집을 규명하기 위해 Illumina iSeq 100 장비를 이용하여 제시된 프로토콜에 따라 박테리아 및 고세균의 16S rRNA amplicon sequencing을 수행하였다33). Amplicon PCR에서는 박테리아(518F: 5’-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3’, 805R: 5’-GACTACCAGGGTATCTAATCC-3’)와 고세균(787F: 5’-ATTAGATACCCSB_GTAGTCC-3’, 1059R: 5’-GCCATGCACCWCCTCT-3’)에 특이적인 16S rDNA 서열에 Illumina overhang adapter 서열을 추가한 올리고머를 사용하였다. PCR 후, 정제된 DNA로 index PCR을 수행한 뒤, 45 pM로 library pooling을 진행하고, PhiX sequencing control과 혼합하여 염기서열 분석을 진행하였다.

VSEARCH 알고리즘[34]을 사용해 quality check 및 data filtering을 수행한 뒤, 참조 서열에 의존하지 않고 de novo OTU (operational taxonomic unit) clustering을 하였으며, sequence identity cutoff는 97%로 설정하였다. 이후 RDP (ribosomal database project) classifier 알고리즘과 동일 데이터 베이스를 사용하여 taxonomy assignment를 진행하였다[35,36]. 그 결과, 샘플당 17,000개(박테리아) 또는 14,000개(고세균) 이상의 유효 서열(valid reads)을 얻었으며, confidence score가 80% 미만인 OTU는 unclassified로 지정하였다. 추출된 OTU의 점유율 및 계통학적 정보에 기반하여 weighted UniFrac 분석을 실시하고, 결과를 nMDS(non-metric multidimensional scaling) 플롯으로 시각화하였다. 또한, 메탄 생성량 및 미생물 그룹 간의 상관성을 평가하기 위해 Spearman 상관 분석을 실시하였으며, 유의 수준 p <0.05에서 분석 결과를 확인하였다.

3. 결과 및 고찰

3.1. 접종원 및 기질의 성상 분석 결과

본 연구에서 사용한 접종원(inoculum; Ino) 및 기질로 활용한 탈수케이크(sludge cake; SC)는 이전 논문[29]에서 보고한 것과 동일하며, 그 성상을 Table 1에 요약하였다. 탈수케이크는 낮은 함수율(82.9%; 170.8 g TS/kg)과 고농도의 유기물(131.5 g VS/kg; 220 g COD/L) 및 질소 함량(5.8 g TN/L, 2.3 g TAN/L)을 보였다[29].

탈수케이크는 냉장 후 분쇄(1차 배치) 또는 냉동-해동(2~4차 배치, 총 1~3회 반복) 후 분쇄하여 사용하였다. 기질 보관 방법에 따라 발생된 유기물 가용화도 변화를 확인하기 위해 총고형분(TS), 휘발성 유기물(VS), 총 화학적 산소 요구량(TCOD), 용존 화학적 산소 요구량(SCOD)을 각 배치마다 측정하였다(Table 2). 그 결과, TS, VS, TCOD 함량은 전체 배치의 표준편차가 평균값의 약 3% 미만으로 유지되어 배치 횟수에 따른 변화가 관찰되지 않았으나, SCOD는 현저히 증가하는 경향을 보였다. 특히, SCOD 함량이 1차 배치 대비 2차 배치에서 3.0배 증가하였고, 3차 및 4차 배치에서는 이전 배치의 1.15배씩 증가하였다. 즉, 냉동-해동을 반복하는 효과보다 1회 냉동 보관 후 분쇄했을 때 유기물 가용화가 크게 증가한다는 것을 확인하였다.

배치에 따라 증가된 유기물 성분을 규명하고자 에탄올(ethanol; EtOH) 및 휘발성 유기산(volatile fatty acids; VFAs) 함량을 GC(gas chromatograph)로 측정하고, 이들로부터 유래하는 이론적 SCOD를 계산하였다(Table 3). 그 결과, 에탄올 및 8종 유기산이 Table 2에서 측정한 SCOD의 45%~61%를 차지하는 것으로 나타났다.

3.2. 할로이사이트 및 자철석 분말을 투입한 연속 회분식 혐기성 소화 실험

할로이사이트(H)와 자철석(M) 분말을 각각 1 g/L(H1, M1), 10 g/L(H10, M10), 50 g/L(H50, M50)의 농도로 투입하고, 탈수 케이크를 기질로 사용하여 4회차에 걸쳐 회분식 실험을 진행하였다. 생산된 총 바이오가스 중 메탄 비율은 모든 반응조에서 각 배치마다 유사하게 나타나, 할로이사이트 및 자철석 분말의 투입이 메탄 비율에 큰 영향을 미치지 않음을 시사하였다(1차: 62.5 ± 0.6%, 2차: 71.1 ± 0.7%, 3차: 71.1 ± 0.4%, 4차: 71.9 ± 0.5%). 첫 배치 시작 시점의 반응조 pH는 8.0 ± 0.1였으며, 실험 과정 중 분말 투입에 따른 pH 변화는 관찰되지 않았고, 모든 배치의 종료 시점 pH는 7.8 ± 0.1로 나타났다.

각 배치에서 배양 시간에 따른 기질 유기물 함량당 누적 메탄 발생량(N mL/g COD)을 계산하여 Fig. 3에 그래프로 나타내었다. 2차 배치때부터는 가스 발생이 종료된 후 기질을 투입하였으므로, 모든 메탄 발생은 새로 투입한 기질에서 유래했다고 가정하고 산출하였다. 다만, 1차 배치에서는 접종원에서 유래한 메탄 발생이 남아있을 수 있어 해당 값을 별도로 측정하고 그날의 각 반응조 메탄 발생량에서 제외하였다. 접종원 유래 메탄 발생량은 1차 배치 배양 1일차에 0.18 N mL/mL inoculum에서 시작해 배양일이 경과할수록 감소하여 배치 종료시점에서는 0.03 N mL/mL inoculum으로 감소하였다.

각 배치 및 반응조별 총 메탄 수율은 Table 4에 정리하였다. 1차 배치의 평균 메탄 수율은 196 mL/g COD, 2차 배치에서는 280 mL/g COD로서 1차 대비 42.6% 증가한 값을 보였다. 전술한 대로(Table 2), 2차 배치에서 메탄 생성량의 증가는 기질을 냉동 후 분쇄함으로써 유기물 가용화도가 크게 증가(SCOD 3배 증가)했기 때문일 것으로 해석된다. 2차 배치 이후 냉동-해동 반복에 따른 기질의 SCOD 증가율은 12.2%(2차 대비 3차), 18.7%(3차 대비 4차)였으나 총 메탄 생성량의 증가는 관찰되지 않았다.

할로이사이트 또는 자철석 분말이 총 메탄 수율에 미치는 영향을 평가하기 위해 각 배치에서 대조군 대비 총 메탄 수율의 차이를 백분율로 계산하였다(Table 4). 그 결과, 최소 -6.2%에서 최대 4.6%의 작은 차이가 관찰되었고, 일정한 증가나 감소 경향이 보이지 않았다. Welch의 t-검정을 사용한 양측검정 결과, 3차 배치의 H10 반응조(p=0.03)와 4차 배치의 H50 반응조(p=0.06)에서만 유의미한 차이가 나타났으나, 그 외의 배치와 반응조는 모두 p 값이 0.1 이상이었다. 이는 특정 농도의 분말 투입이 총 메탄 생성량에 유의미한 영향을 미치지 않았음을 시사하였다.

실험 결과를 modified Gompertz 모델에 적용하여 메탄 생성 공정의 동역학적 특성을 분석하였다. 모든 조건에서 모델의 예측 정확도는 R² 값이 0.990에서 0.998 사이(평균 0.995)로 나타나, 모델이 실험 데이터를 매우 잘 설명함을 확인할 수 있었다. 이 과정에서 지연 기간(λ), 최대 메탄 생성 속도(R_m), 총 메탄 수율의 80%가 발생하는 시점(T₈₀), 총 메탄 생산량(B_G)에 해당하는 주요 지표를 도출하여 Table 5에 정리하였고, 이 중 메탄 생성 속도와 관련된 지표(λ, R_m, T₈₀)는 Fig. 4에 시각화하였다.

메탄 생성 속도가 빨라질수록 λ와 T₈₀은 감소하고, R_m은 증가하는 경향을 보인다. 전 반응조에서 3차 배치까지는 배치 회차가 진행될수록 메탄 생성 속도가 빨라지는 경향이 관찰되었다. 이러한 경향은 1차 대비 2차 배치에서 크게 두드러졌고, 3차 배치까지 모든 반응조에서 관찰되었으나, 3차 대비 4차 배치에서는 메탄 생성 속도가 비슷하거나 다소 느려졌다(Table 5, Fig. 4). 1차 대비 2차 배치에서 λ는 4.56~5.40일에서 1.16~1.43일로, T₈₀은 19.6~21.5일에서 7.81~9.14일로 단축되었고, R_m은 11.0~12.3에서 31.1~37.6 N mL/g COD/d로 증가하였다. 대조군 반응조(Ctrl)의 1차 대비 2차 배치의 메탄 생성 속도를 살펴보면, λ는 5.04에서 1.43일로, T₈₀은 20.6에서 9.01일로 단축되었고, R_m은 11.6에서 33.1 N mL/g COD/d로 증가하였다. 모든 반응조는 3차 배치에서 λ는 0.62~0.94일, T₈₀은 6.38~7.91일, R_m은 35.1~41.5 N mL/g COD/d 범위의 값을 보이며, 하루 이내의 지연 기간과 8일 이내의 T₈₀ 값을 나타냈다. 3차 배치까지 모든 반응조에서 메탄 생성 속도가 빨라진 이유는 2차 배치부터 가용화도가 크게 증가한 기질을 투입하였고, 해당 기질(유기물)의 분해에 적응한 미생물이 배치가 진행될수록 축적되었기 때문으로 해석된다.

3차 배치에서 각 반응조는 메탄 생성 속도의 최대치에 도달한 것으로 보이며, 이후 4차배치에서는 반응 속도가 유지되거나 다소 둔화되었는데, 이는 축적된 암모니아 농도 때문일 수 있다. 기질에서 유래한 질소가 모두 암모니아로 변환된다고 가정할 때, 각 배치 종료 시점에서 예상되는 TAN(총 암모니아 질소) 농도는 0.70 g/L(1차)에서 1.51 g/L(4차)까지 증가하는 것으로 예측되었다. 혐기소화에서 미생물 저해를 일으키지 않는 TAN 농도 범위는 통상 1.5 g/L까지이므로[37], 4차 배치에서의 TAN 농도는 메탄 생성 속도에 다소 저해를 일으켰을 가능성이 있다. 그러나 4차 배치에서도 분말을 저농도로 투입한 H1 및 M1 반응조를 제외한 모든 반응조에서 Ctrl보다는 개선된 메탄 생성 속도(λ 단축, 및 T₈₀ 단축, R_m 증가)를 보였다(Table 5 & 6).

한편, 기질에서 유래한 나트륨 농도는 이는 미생물 저해를 일으킬 수 있는 농도(3 g/L) [37]보다 훨씬 낮을 것으로 계산되어 나트륨 농도의 영향은 없을 것으로 판단하였다.

할로이사이트 또는 자철석 분말을 투입한 반응조의 Gompertz 동역학 파라미터(λ, R_m, T₈₀, B_G) 값들의 대조군 대비 변화율(%)를 계산하여, 각 조건이 혐기소화에 미치는 개선 효과를 평가하였다(Table 6). 할로이사이트 50 g/L (H50) 조건에서는 모든 배치에서 메탄 생성 속도가 증가하는 경향이 나타났다. 지연 기간(λ) 및 T₈₀(총 메탄 생성의 80%가 발생하는 시점)이 대조군 대비 각각 9.6~31.4%와 5.2~19.4% 단축되었고, 최대 메탄 생성 속도(R_m)는 4.5~17.6% 증가하였다. H50 조건에서 λ는 배치가 반복될수록 점차 단축되었으며, R_m과 T₈₀은 3차 배치까지 꾸준히 증가하다가 4차 배치에서는 다소 감소하였다. 이는 대조군의 미생물 군집 역시 배치가 진행될수록 기질에 적응하여 H50과의 차이가 줄어든 것으로 판단된다. 할로이사이트를 1 g/L (H1), 10 g/L (H10)로 투입한 경우에는 H50에 비해 효과가 작았으나, 최소 두 차례의 배치에서 지연 기간 단축 및 R_m 증가 경향이 관찰되었다.

할로이사이트 분말이 메탄가스 발생 속도에 미치는 영향을 설명하기 위한 가설 메커니즘은 다음과 같다. 할로이사이트는 나노미터 크기의 튜브 형태로 존재하여 동일 질량 대비 넓은 표면적을 제공한다. 외부 표면은 규산염에 의해 음전하를 띠어 양이온 물질(금속 이온 등)을 흡착할 수 있으며, 내부 표면은 알루미늄 산화물 층에 의해 양전하를 띠어 음이온 물질(유기산, 인산염 등)을 흡착할 수 있다[21]. 미생물 또한 세포 외벽에 전하를 띠고 있으며, 특히 박테리아는 대개 음전하 표면을 가진다고 알려져 있다[38]. 이러한 특성으로 인해 할로이사이트는 음전하 및 양전하를 가진 다양한 유기물과 미생물이 접촉할 수 있는 표면적을 제공할 것이다. 할로이사이트가 이러한 표면적을 통해 유기물과 미생물 간의 물리적 접촉을 증가시키면, 미생물에 의한 유기물의 산화환원 반응 속도가 빨라져 메탄가스 발생 속도가 증가할 것으로 추정된다.

한편, 자철석 분말을 투입한 경우에는 1 g/L로 투입한 반응조(M1)는 1차와 2차 배치에서 메탄 생성 속도가 단축되었으나, 배치가 진행될수록 이러한 경향이 사라지는 모습을 보였다(Table 6). 시간이 지날수록 M1과 대조군의 메탄 생성 속도 차이가 미비해진 것은 대조군 반응조(Ctrl) 또한 기질 분해에 적응하면서 M1과의 격차가 좁혀졌기 때문일 수 있다. 기존 연구에서 자철석 효과가 나타나는 농도는 다양하나, 1 g/L도 효과가 나타난 범위에 속한다[39]. 자철석의 효과는 혐기소화에 특별한 저해 요인이 없는 경우에도 나타나지만[39], 유기산이 축적되거나 암모니아나 황산염(sulfate) 농도가 높아진 저해 조건에서도 보고되었다[40-44]. 본 연구는 4차 배치에서 암모니아 축적이 1.51 g/L에 도달하여 미세한 저해가 있을 수 있었으나, 대부분 뚜렷한 저해 요인이 없는 혐기소화 조건에서 자철석 분말의 효과를 관찰한 경우이다. 본 연구 결과는 자철석을 특별한 저해가 없는 환경에서 저농도로 투입 시 시간이 지날수록 그 효과가 미비해질 수 있음을 시사하였다.

반면, M10과 M50 반응조는 초기 배치에서는 오히려 Ctrl에 비해 일일 메탄 최대 생산 속도(R_m) 값이 낮았는데, 3차 배치 이후에는 분말 투입 농도가 높을수록 증가하였다. 즉, 4차 배치에서 M10과 M50 반응조는 지연 기간(λ)이 22.6~39.3% 단축되고, 최대 메탄 생성 속도(R_m)는 4.2~13.2% 증가하였으며, T₈₀은 10.5~16.0% 단축되는 개선 효과가 확인되었다. 이렇게 초기 배치에서 자철석 농도가 높을수록 최대 메탄 생성 속도가 낮았던 이유는 높은 농도의 자철석이 초기에는 미생물 활동을 억제했을 가능성을 고려할 수 있다. 고농도의 금속성 물질은 일정 조건에서 미생물 대사에 방해가 될 수 있으며, 이러한 억제 효과가 미미하게나마 작용했을 수 있다[45]. 그러나 시간이 지남에 따라 배치가 진행될수록 미생물들이 자철석의 전자전달 혜택에 적응하면서 메탄 생성 속도가 회복되고, 오히려 개선된 것으로 볼 수 있다.

3.3. 미생물 군집 분석

각 배치 종료 시점에서 미생물 군집 분석을 수행하여 박테리아는 phylum(門; 문), family(科; 과) 및 genus(屬; 속) 단계, 고세균은 genus 단계의 점유율을 Fig. 5에 나타내었다. 발견된 주요 박테리아 phylum은 Pseudomonadota(38.7~71.3%), Bacillota(9.7~25.2%), Bacteroidota(9.0~18.0%)였으며, 이들은 광범위한 유기성 기질을 휘발성 지방산으로 분해하는 능력이 뛰어나 혐기소화조에서 흔히 발견되는 그룹으로 알려져 있다. 그 외 최대 1.5% 미만의 점유율을 보인 phylum은 Cloacimonetes와 Synergistota였다. 주요 family는 Comamonadaceae(19.9~41.3%), Ancalomicrobiaceae(11.3~29.3%), Gracilibacteraceae(0.2~11.7%), Xanthomonadaceae(2.9~5.8%)였으며, Xanthomonadaceae는 Bacillota에 속하고, 나머지는 Pseudomonadota에 속하였다. 발견된 주요 genus는 Comamonadaceae 하위의 Brachymonas (15.7~37.2%)와 Ancalomicrobiaceae 하위의 Pinisolibacter (11.3~29.3%)였다. 고세균 중 우점도가 높은 주요 genus는 Methanoculleus(65.9~87.2%), Methanothrix(6.3~22.1%)였으며, 그 외에는 Methanospirillum(0.8~6.9%), Methanolinea(0.5~2.7%), Methanomassillicoccus(1.2~4.1%), Methanosarcina(0.3~3.7%)가 차지하였다.

각 반응조의 미생물 군집 구조 유사도는 weighted UniFrac 분석으로 계산하였고, 그 결과를 nMDS 플롯으로 2차원에 시각화하였다. 연속 배치에 따른 군집 이동은 화살표로 표시하였다(Fig. 6). nMDS 상에서 거리가 가까운 시료일수록 군집 유사성이 높고, 거리가 멀수록 유사성이 낮다는 것을 의미한다. 그러나 거리의 절대적인 수치는 해석에 큰 의미가 없고, 군집 간의 상대적인 순위가 중요한 정보이다.

박테리아의 경우, 자철석은 투입 농도에 따라 모든 배치에서 군집 간의 거리가 비교적 일정하게 유지되어, 투입 농도와 박테리아 군집 간의 상관관계가 있을 것으로 예측되었다. 반면, 할로이사이트는 투입 농도에 따른 일정한 경향성이 나타나지 않았다(Fig. 6(A)). 특히, H50 조건에서는 1차에서 2차 배치 종료 시 군집 구조가 극단적으로 변화하여, 모든 반응조 중에서 가장 큰 변화를 나타냈다. 1차 배치 대비 2차~4차 배치에서 기질의 SCOD 농도가 높았는데, 고농도의 할로이사이트(H50)가 많은 양의 용존 유기물에 흡착했을 때 박테리아 군집이 크게 바뀌는 것으로 생각된다. 또한, H50과 M50 대조군이 서로 가장 반대편에 위치한다는 것은 두 분말이 미생물에 미치는 기작이 다를 가능성을 암시하였다.

고세균은 nMDS 상의 군집 간 거리가 박테리아의 약 0.1배 수준으로 가까웠으며(Fig. 6(B)), 이는 박테리아보다 군집 구조가 서로 유사함을 나타낸다. 특히, 1차보다 4차 배치 종료 시점에서 군집들이 더욱 가깝게 위치하였다.

3.4. 할로이사이트 및 자철석 분말의 투입 농도와 Gompertz 동역학 변수 및 미생물 그룹 간의 상관관계 분석

본 연구는 두 분말의 투입이 메탄 생성 속도에 미치는 영향을 미생물 군집 변화를 통해 설명하고자 하였다. 두 분말의 투입 농도, Gompertz 동역학 변수, 그리고 Fig. 5에서 확인한 미생물 그룹 간의 상관관계를 Spearman 상관 분석으로 각 배치별로 평가하여, p < 0.05에서 유의미한 변수들과 그 상관계수를 Table 7에 정리하였다.

그 결과, 자철석 투입 농도와 유의미한 상관관계를 보인 미생물 그룹은 총 32개 중 16개로 가장 많았으며, 지연기간(λ)과는 11개 그룹이 상관관계를 보였다. 할로이사이트 투입 농도, R_m, T₈₀과 유의미한 상관관계를 보인 그룹은 각각 7개씩 도출되었다. 유의미한 상관관계는 대부분 4회의 배치 중 1~2번 나타났으나, 최대 3번까지 상관관계가 도출된 그룹도 있었다. 이는 자철석 투입 농도와 양의 상관관계를 보인 Methanosarcina와 Geobacter, 그리고 지연기간과 양의 상관관계를 보인 Porphyromonadaceae였다.

Geobacter는 자철석 투입 농도와 1차 배치부터 3차 배치까지 총 3번 양의 상관관계(0.88~1.00)를 보였으며, 이는 자철석 투입 농도가 높을수록 Geobacter가 우점하는 것을 나타낸다. Methanosarcina는 자철석 투입 농도와 양의 상관관계를 보인 유일한 고세균으로, 2차부터 4차 배치에서 유의미한 양의 상관관계(0.79~0.91)를 나타냈다. Methanosarcina와 Geobacter는 전자 제공 박테리아와 전자 수용 메탄생성균으로서 짝을 이루어 DIET 기작에 관여했을 가능성이 크며, 이는 기존 문헌에서도 보고된 바 있다[18].

한편, Methanosarcina는 자철석 투입 농도와 양의 상관관계를 보였으나, 할로이사이트 투입 농도와는 2차 및 3차 배치에서 음의 상관관계(-0.91)를 나타냈다. 반면, Methanomassiliicoccus는 할로이사이트와 두 번의 배치에서 강한 양의 상관관계(0.91)를 보였으나, 자철석과는 음의 상관관계(-0.77, -0.87)를 나타냈다. 고세균의 nMDS plot(Fig. 6(B))에서 자철석과 할로이사이트 반응조들이 대조군을 사이에 두고 서로 반대편에 위치하는 경향을 보였는데, Methanosarcina와 Methanomassiliicoccus의 두 그룹이 이러한 상반된 경향을 설명해주는 것으로 보인다.

할로이사이트와 양의 상관관계를 보인 다른 미생물은 Methanolinea로, 1번의 배치에서 상관성을 나타냈다. 그 외 할로이사이트 투입 시 2회 이상의 양의 상관관계를 보인 미생물 그룹은 발견되지 않았다. 이는 할로이사이트가 특정 미생물 그룹에 작용하기보다는, 다양한 미생물이 넓은 범위의 기질과 효과적으로 접촉할 수 있는 물리적 표면을 제공하여 반응 속도를 증가시키고, 결과적으로 메탄 생성 속도를 촉진했을 가능성을 시사한다.

메탄 생성 속도와 관련된 미생물 중 3번 이상의 상관관계를 보인 그룹은 Porphyromonadaceae뿐이었으나(0.79~0.89), 이는 메탄 생성 속도의 지연과 관련이 있었다. 따라서 메탄 생성 속도의 향상과 유력한 관계를 보이는 특정 미생물 그룹은 발견되지 않았다고 판단하였다.

4. 결 론

본 연구는 혐기성 소화 과정에서 할로이사이트와 자철석 분말이 메탄 생성에 미치는 영향을 평가하고자 도계장에서 유래한 탈수 케이크를 기질로 하여 총 4차에 걸친 회분식 실험을 수행하였다. 실험은 뚜렷한 저해 요인 없이 14.8 g COD/L로 초기 조건을 설정하였고, 분말 농도는 1, 10, 50 g/L로 나누어 각각의 누적 메탄 생성량과 Gompertz 동역학 변수를 비교 분석하였다. 연구 결과, 두 분말 모두 총 메탄 생성량에는 유의미한 영향을 미치지 않았으나, 메탄 생성 속도와 관련된 지연 기간(λ), 최대 생성 속도(R_m), 및 T₈₀의 개선이 확인되었다. 특히, 할로이사이트 50 g/L (H50) 조건은 모든 배치에서 메탄 생성 속도가 증가하는 경향을 보였으며, 최대 31.4%의 지연 기간 단축, 19.4%의 T₈₀ 단축, 17.6%의 최대 생성 속도 향상을 기록하였다. 자철석 분말은 초기 배치에서 저농도(1 g/L, M1) 조건이 유효했으나, 3차 이후 고농도(10 및 50 g/L)에서 지연 기간 단축과 생성 속도 향상이 나타났다. 미생물 군집 변화에서는 자철석 투입량의 증가에 따라 DIET 관련 Geobacter와 Methanosarcina의 우점화가 나타난 반면, 할로이사이트는 Methanosarcina 비율이 감소하는 경향을 보였다. 또한, 할로이사이트는 특정 박테리아 그룹에 작용하기보다는 광범위한 박테리아에 대해 비특이적으로 작용할 것으로 해석된다. 본 연구 결과는 할로이사이트와 자철석 분말이 메탄 생성 속도 향상에 기여할 수 있음을 시사하며, 혐기성 소화 공정 개선을 위한 실용적 가능성을 제안한다. 향후 미생물 군집 변화와 메탄 생성 간의 상호작용에 대한 심층 연구가 진행된다면, 이를 바탕으로 공정 조건을 최적화하는 데 도움이 될 것으로 기대된다.

Acknowledgments

본 연구는 한국연구재단(No. 2020R1C1C1013643, RS-2024-00410127)의 지원을 받아 수행되었습니다.

Notes

Declaration of Competing Interest

The authors declare that they have no known competing financial interests or personal relationships that could have appeared to influence the work reported in this paper.

Fig. 1.

Direct interspecies electron transfer (DIET) between exoelectrogenic bacteria and electrotrophic methanogens via (A) biotic compounds and (B) abiotic conductive material[15].

Fig. 2.

Structure of halloysite nanotube (HNT)[21].

Fig. 3.

Cumulative methane production (N mL/g COD) during serial batch experiments (batch 1 to 4) on anaerobic digestion of sludge cake with halloysite (H) or magnetite (M) powder added at concentrations of 1, 10, and 50 g/L. Control results are shown in both the H (top row) and M (bottom row) graphs.

Fig. 4.

Estimated Gompertz kinetic parameters (λ, R_m, T₈₀) for control, halloysite (H), and magnetite (M) at concentrations of 1, 10, and 50 g/L across serial batch experiments (B1–B4). λ: lag phase duration (days), R_m: maximum methane production rate (N mL/g COD/day), T₈₀: time to reach 80% of total methane production (days).

Fig. 5.

Microbial community structures at the levels of (A) bacterial phylum, (B) bacterial family, (C) bacterial genus, and (D) archaeal genus observed at the end of serial batch experiments (B1 to B4) with control and with halloysite (H) or magnetite (M) additions at concentrations of 1, 10, and 50 g/L. Operational taxonomic units (OTUs) clustered using a 97% similarity cutoff that are unidentified or unclassified are not shown. The bar graphs are arranged with the most abundant taxa in the M50 sample (for bacteria) or H50 sample (for archaea) from B4, followed by other taxa in descending order.

Fig. 6.

NMDS plots of weighted UniFrac results for (A) bacteria and (B) archaea. The plots depict changes in microbial community structure at the end of each of the four serial batch experiments, which included control, halloysite (H), or magnetite (M) additions at concentrations of 1, 10, and 50 g/L. Arrows indicate the progression from one batch to the next.

Table 1.

Characteristics of the inoculum and poultry slaughterhouse sludge cake (SC). [29]

Parameter	Unit	Inoculum	SC
pH	-	7.91	6.86
Alkalinity (pH 3.8)	mg/L as CaCO₃	14182	14460
TS	g/kg	27.49	170.8
VS	g/kg	16.68	131.5
COD	g/L	N.M.	220.0
TN	mg/L	N.M.	5824
TAN	mg/L	1342	2259
C	dry %	28.7	39.4
H	dry %	4.49	6.59
O	dry %	63.4	49.7
N	dry %	3.40	4.29
S	dry %	N.D.	N.D.

N.M., not measured; N.D., not detected

Table 2.

Organic content of sludge cake (SC) in serial batch (B) experiments (impact of freeze-thaw cycles and blending on SCOD).

Parameter	Unit	B1	B2	B3	B4	Average^*
TS	g/kg	170.8	174.7	172.8	176.7	173.8
TS	g/kg	170.8	174.7	172.8	176.7	1.95 (1.12%)
VS	g/kg	131.5	128.5	120.9	128.0	127.2
VS	g/kg	131.5	128.5	120.9	128.0	3.46 (2.72%)
VS/TS	%	77.0%	73.6%	70.0%	72.4%	73.2
VS/TS	%	77.0%	73.6%	70.0%	72.4%	2.24 (3.06%)
TCOD	g/L	220.0	223.2	217.0	221.0	220.3
TCOD	g/L	220.0	223.2	217.0	221.0	2.01 (0.91%)
SCOD	g/L	3.39	10.11	11.34	13.46	9.58
SCOD	g/L	3.39	10.11	11.34	13.46	3.37 (35.2%)
SCOD/TCOD	%	1.50%	4.50%	5.20%	6.10%	4.33
SCOD/TCOD	%	1.50%	4.50%	5.20%	6.10%	1.54 (35.7%)

^* The average values are shown with ± standard deviation (percentage of the average).

Table 3.

Concentration of ethanol (EtOH) and volatile fatty acids (VFAs) in sludge cake (SC) used for serial batch (B) experiments (mg/L).

Compound	Unit	B1	B2	B3	B4	Average^*
Ethanol	mg/L	6.9	4.0	2.3	1.0	3.5
Ethanol	mg/L	6.9	4.0	2.3	1.0	2.2 (62.0%)
Acetic acid	mg/L	1098.4	3876.6	3933.9	4027.2	3234.0
Acetic acid	mg/L	1098.4	3876.6	3933.9	4027.2	1234.2 (38.2%)
Propanoic acid	mg/L	341.2	849.6	879.9	866.9	734.4
Propanoic acid	mg/L	341.2	849.6	879.9	866.9	227.3 (30.9%)
Isobutyric acid	mg/L	73.6	135.0	137.3	133.2	119.8
Isobutyric acid	mg/L	73.6	135.0	137.3	133.2	26.7 (22.3%)
Butyric acid	mg/L	12.3	15.4	16.7	15.6	15.0
Butyric acid	mg/L	12.3	15.4	16.7	15.6	1.6 (10.8%)
Isovaleric acid	mg/L	156.4	294.3	295.7	288.1	258.6
Isovaleric acid	mg/L	156.4	294.3	295.7	288.1	59.1 (22.8%)
Valeric acid	mg/L	15.8	14.5	14.0	15.3	14.9
Valeric acid	mg/L	15.8	14.5	14.0	15.3	0.7 (4.7%)
Isocaproic	mg/L	11.8	10.3	9.4	11.9	10.9
Isocaproic	mg/L	11.8	10.3	9.4	11.9	1.0 (9.5%)
Caproic acid	mg/L	37.8	13.1	10.6	9.9	17.8
Caproic acid	mg/L	37.8	13.1	10.6	9.9	11.6 (65.0%)
VFAs & EtOH	mg/L	1754.3	5212.8	5299.7	5369.1	4409.0
VFAs & EtOH	mg/L	1754.3	5212.8	5299.7	5369.1	1533.7 (34.8%)
Theoretical SCOD from VFAs & EtOH	g COD/L	2.05	5.90	5.99	6.07	5.0
Theoretical SCOD from VFAs & EtOH	g COD/L	2.05	5.90	5.99	6.07	1.7 (34.1%)

^* The average values are shown with ± standard deviation (percentage of the average).

Table 4.

Experimental methane production (Bex) and relative changes (% vs. control) for control, halloysite (H), and magnetite (M) at concentrations of 1, 10, and 50 g/L across serial batch experiments (B1–B4).

Table 5.

Estimated Gompertz kinetic parameters (λ, R_m, T80, BG) for control, halloysite (H), and magnetite (M) at concentrations of 1, 10, and 50 g/L across serial batch experiments (B1–B4).

	λ (d)				R_m (N mL/g COD/d)				T₈₀ (d)				B_G (N mL/g COD)
	B1	B2	B3	B4	B1	B2	B3	B4	B1	B2	B3	B4	B1	B2	B3	B4	Total	Average
Ctrl	5.04	1.43	0.94	0.94	11.6	33.1	35.3	36.0	20.6	9.01	7.91	7.92	197	273	267	274	1011	996 ± 15.6 (1.57%)
H1	5.40	1.31	0.85	0.80	11.2	33.5	36.2	35.4	21.5	8.46	7.45	7.88	196	261	260	272	989
H10	5.11	1.24	0.72	0.83	11.4	31.1	39.8	37.6	21.1	9.14	6.66	7.35	198	267	257	267	989
H50	4.56	1.16	0.69	0.64	12.3	37.6	41.5	37.7	19.6	7.81	6.38	6.86	201	272	256	254	984
M1	4.81	1.32	0.90	1.00	11.9	34.5	35.1	35.8	20.2	8.92	7.90	8.08	200	286	268	275	1028
M10	4.70	1.30	0.62	0.57	11.8	32.1	38.2	37.6	20.0	8.95	6.81	7.09	196	267	257	266	987
M50	4.92	1.28	0.63	0.72	11.0	32.9	39.7	40.8	20.8	8.68	6.79	6.66	191	264	266	263	984

λ: lag phase duration (days), R_m: maximum methane production rate (N mL/g COD/day), T₈₀: time to reach 80% of total methane production (days), B_G: total methane production (N mL/g COD)

Table 6.

Relative changes (% vs. control) in Gompertz kinetic parameters (λ, R_m, T₈₀, B_G) for halloysite (H) and magnetite (M) additions at 1, 10, and 50 g/L across serial batch experiments (B1–B4).

Table 7.

Spearman correlation (p < 0.05) between halloysite (H) and magnetite (M) concentrations, Gompertz kinetic parameters (λ, R_m, T₈₀) and microbial community structures across four batch experiments.

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