주기적인 초음파 조사에 따른 Microcystis aeruginosa의 성장억제 분석
Analysis of Growth Inhibition for Microcystis aeruginosa with Periodic Ultrasonic Irradiations
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Abstract
목적
장기적인 조류 성장억제 효과를 위하여 초음파 1차 조사 종료 이후 일정기간 조류 성장억제가 지속된 후 Microcystis aeruginosa (M. aeruginosa)의 재성장 시 초음파의 재조사(re-irradiation)를 통해 Microcystis aeruginosa의 성장억제 효과를 조사하고, 조류 성장억제 효율과 효과의 지속성을 확인하기 위하여 실험실 규모 실험을 진행하였으며 이를 바탕으로 다양한 분석을 진행하였다.
방법
대조군 A(0 hr)과 초음파 1차 조사만 적용한 실험군 B(2 hr), 2차 조사를 적용한 실험군 C(0.5hr), D(1 hr), E(1.5hr)으로 구분하여 각 조건별로 실험을 진행하였다. 초음파 조사 조건은 주파수(frequency) 23 kHz, 출력(intensity) 6.94 W L-1으로 적용하였으며, 초음파 2차 조사의 경우 1차 조사 이후 조류가 재성장(regrowth)하는 시점(7 day)에 초음파 재조사를 진행하였다.
결과 및 토의
Chlorophyll-a (Chl-a) 및 M. aeruginosa의 개체수(cell number) 분석 결과, 초음파 1차 조사만 적용한 실험군(B)은 저감 이후 조류의 급격한 재성장이 진행된 반면, 초음파 2차 조사를 적용한 실험군(C, D, E)은 초음파의 조사시간이 줄어들어도 조류의 재성장이 지연되는 것을 확인하였다 비성장속도(µ)와 일차분해속도(k)를 도출한 결과, 재성장 기간 동안 초음파 2차 조사를 적용한 실험군(C, D, E)은 반복적인 조류 성장 불능화로 인하여 초음파 1차 조사만 적용한 실험군(B) 대비 성장률이 상대적으로 낮은 것을 확인하였다. 또한 SEM, TEM 분석 결과, 초음파의 영향으로 조류 세포의 손상이 뚜렷하게 관측되었으며 대조군 대비 실험군은 M. aeruginosa 세포 내 기낭의 분포 감소와 세포막의 변형을 관찰하였다.
결론
본 연구를 통해 초음파 조사에 의한 조류 성장억제 효과를 확인하였으며, 초음파의 재조사는 반복적인 조류 성장 불능화(inactivation)에 기여하여 재조사 시, 1차 조사 대비 초음파 조사시간을 단축하여도 조류의 재성장에 필요한 시간은 더욱 증가되는 것을 확인하였다. 따라서, 정체수역 내 장기적 조류 성장억제를 위해서는 주기적인 초음파 조사가 필요하나, 초음파의 적정 조사 주기는 실제 현장의 규모, 조류 발생정도, 수온, 광량, 영양염류, 유속 등 다양한 복합적 인자의 영향에 따라 상이할 것으로 예상되며, 최적화된 초음파 조사 프로토콜을 수립하기 위해서는 다양한 조건에서의 부지특이성을 고려한 현장 연구가 필요할 것으로 판단된다.
Trans Abstract
Objectives
To confirm both efficiency and sustainability of algal growth inhibition, various laboratory-scale experiments were conducted and the growth inhibitory effect of Microcystis aeruginosa (M. aeruginosa) was investigated through ultrasonic re-irradiation during the regrowth period after the first ultrasound irradiation.
Methods
Experiments with different times of irradiation [i.e., control group A (0 hr), experimental group B (2 hr) applied with only the first ultrasound irradiation, and experimental group C (0.5 hr), D (1 hr), and E (1.5 hr) applied with both first and second irradiations] were performed.
Results and Discussion
As a result of both Chlorophyll-a (Chl-a) concentration and cell number of M. aeruginosa, the experimental group (B) with only first ultrasound irradiation (2 hr) displayed rapid regrowth of algae after initial decrease whereas the experimental group (C, D, and E) with both first ultrasound irradiation (2 hr) and second ultrasound irradiation (0.5 hr, 1 hr, and 1.5 hr) confirmed the delay of algae regrowth. Based on the specific growth rate constant (µ) and first order decay rate constant (k), algal growth from the experimental groups (C, D, E) with the secondary ultrasound irradiation was more significantly inhibited due to repetitive inactivation of algae growth. According to the SEM and TEM results, damages to algae cells were clearly observed under the influence of ultrasound, and both decrease in gas vesicles and rupture of cell membrane in M. aeruginosa were also monitored.
Conclusion
Through this study, the algae growth inhibitory effect by ultrasonic irradiations was confirmed, and the re-irradiation of ultrasound contributed to the repetitive inactivation of algae growth, indicating that the second ultrasonic irradiation time required to inhibit algal regrowth can be reduced compared to the first irradiation. Therefore, periodic ultrasonic irradiation is required for long-term inhibition of algae growth in stagnant waters, but the appropriate frequency of ultrasonic irradiation may vary depending on the influence of various complex factors such as the size of the stagnant waters, the frequency of algal blooms, water temperature, light irradiation, nutrients, flow rate, etc. Finally, many field studies under various conditions are warranted to establish an optimized ultrasound irradiation protocol.
1. 서 론
녹조현상(algal bloom)은 정체수역에서 조류가 과다 증식하여 수체의 색을 변화시킬 뿐만 아니라 이취미를 발생시켜 수자원으로서 가치를 하락시키며, 수중의 용존산소 감소, 햇빛 차단, 독소로 인한 어류 폐사 등 생태학적인 불균형을 초래한다[1-3]. 최근 도시화･산업화로 인한 담수 자정능력을 초과하는 과도한 영양염류의 유입과 수계 내 다양한 인공구조물에 의한 정체수역 증가 및 전 세계적인 기후변화에 의한 수온 상승 등 다양한 요인들의 복합적 영향으로 유해조류의 과다 증식은 더욱 빈번하며, 그 발생강도 또한 점점 증가하는 추세이다[4-8].
조류는 종류와 생체량이 서로 균형을 이뤘을 때는 과도한 문제가 발생되지 않으나, 단일종 특히 유해남조류의 대발생(Cyanobacterial Harmful Algal Blooms, CyanoHABs) 시 환경적, 경제적, 공중보건 측면에서 심각한 문제를 야기한다[9]. 국내에서 녹조현상을 일으키는 대표종으로 알려진 남조류 Microcystis aeruginosa (M. aeruginosa)는 지오스민(geosmin)과 메틸이소보르네올(2-methylisoborneol)을 생성하여 수계 내 흙 냄새와 곰팡이 냄새 등 취기 물질을 생성하고 간 독소인 마이크로시스틴(microcystin)을 배출하여 수생태계에 위해성을 끼쳐 지속적인 사회 문제로서 대두되고 있다[10-14].
유해남조류의 저감을 위해 흔히 사용되고 있는 조류 저감기술들은 적용 원리에 따라 물리적(physical), 화학적(chemical), 생물학적(biological) 그리고 이들의 복합적(combined) 사용에 의한 기술로 크게 구분된다[15-18]. 최근 연구되고 있는 다양한 HABs 저감 공법 중 물리적 공법인 초음파(ultrasonic)를 이용한 처리기술은 초음파의 공동현상(cavitation)으로 조류 세포 내 기낭을 파괴하여 부력조절 능력을 상실시켜 조류를 호소 바닥으로 가라앉게 하고, 광합성을 차단하여 조류의 성장을 억제하는 기술이다[19-25]. 이러한 초음파 처리 기술은 남조류의 세포분열을 억제하여 조류의 대발생을 예방하고 M. aeruginosa로부터 생성되는 강한 독성을 지닌 microcystin-LR 분해에 효과가 있다고 보고되며, 수체 내 화학약품의 주입 없이 조류 저감이 가능하여 수생태계의 위해성이 낮은 기술이다[26-28].
기존 선행 연구에 따르면, Rajasekhar et al. (2012)은 동일한 초음파 주파수(20 kHz)를 적용하였을 때 조류종별 성장억제 효율(Anabaena circinalis > Microcystis aeruginosa > Chorella sp.)의 차이를 확인하였으며[29], Dehghani (2016), Park et al. (2017)은 조류 성장억제를 위한 최적의 초음파 조사조건은 조류 종별로 다른 것으로 보고하였다[30,31]. 또한 Lee et al. (2018)는 조류의 농도가 높을수록 높은 제거효율이 도출된다고 보고하였으며[32], Wu et al. (2012)는 주파수가 낮을수록, Sim et al. (2006)과 Zhang et al. (2006)은 출력이 높을수록 조류 성장억제 효율이 높게 도출된다고 보고하였다[33-35]. 그러나, 이러한 기존 선행연구의 대부분은 실험 용량이 1.5 L 이하에서 진행되어 단기간 초음파 조사(irradiation)에 따른 일시적인 조류 성장억제 효과를 관찰하였으나, 대용량 및 초음파 조사 이후 장기적 조류 성장억제 효과를 확인하지 못한 한계가 있다. 이러한 한계점을 보완하기 위해 이전 연구(Jang et al., 2022, Kang et al., 2022)에서는 기존 선행연구 대비 대용량(≧ 7.2 L)의 시료를 사용하여 장기적(t ≧ 20 day)인 실험 및 조류 세포수(cell number) 관찰을 통하여 조류 성장억제 효과를 확인하였다[25,36]. 그 결과, 초음파 조사에 따른 M. aeruginosa의 저감이 확인되었으나, 장기적인 관찰을 통하여 초음파 조사에 따른 조류 성장억제 기간(≤ 7 day) 이후 조류의 재성장이 확인되었다.
따라서 본 연구에서는 장기적인 조류 성장억제 효과를 위하여 초음파 1차 조사 후 조류의 재성장 시 초음파의 2차 조사를 통해 M. aeruginosa의 성장억제 효과를 조사하고 조류 성장억제 효율과 지속성을 확인하는 것을 주요 목적으로 하였다. 따라서, 초음파의 조사조건 별 조류의 성장억제 효과를 검증하기 위해 (1) 시료의 육안상 변화, (2) Chlorophyll-a (Chl-a)와 M. aeruginosa의 개체수 변화, (3) M. aeruginosa 개체수를 이용한 비성장속도(µ) 및 일차분해속도(k) 도출 및 (4) SEM(scanning electron microscopy), TEM (transmission electron microscopy) 분석을 통한 M. aeruginosa의 세포 표면 및 내부 형질 변화를 분석하였다.
2. 재료 및 방법
2.1. M. aeruginosa 배양방법
실험에 사용된 남조류 M. aeruginosa는 조류가 과다 발생한 시기에 W 저수지의 물을 채수하여 실험실에서 동정 분리하였다. M. aeruginosa 배양은 표면적 182.5 cm2, 부피 500 mL의 cell culture 플라스크(VWR, Co., America)에 일정량의 M. aeruginosa 시료와 pH 9로 조정한 CB 배지를 접종하여 계대 배양(subculture)을 진행하였다. M. aeruginosa 배양에 사용된 CB 배지의 구체적인 조성은 Jang et al. (2021)에 제시하였으며[7], 배양조건은 온도 27±1℃, 광량 12 µmol-photons m-1 s-1, 광주기 12 hr (light): 12 hr (dark) cycle, 회전속도 28 rpm으로 조류배양장치에서 약 24일간 배양하여 실험에 사용하였다.
2.2. 초음파 발생장치 구성
초음파 조사조건에 따른 M. aeruginosa의 성장억제에 미치는 영향을 비교･분석하기 위해 초음파 구동회로를 조합하여 초음파 발생장치를 제작하였다(AD Sonic, Co., Korea). 본 실험의 초음파 발생장치의 진동판은 19.6 cm2 크기의 Hainertec Co. (China)의 상용화된 제품을 활용하였으며, 고정 주파수(23 kHz)가 발생하도록 조정하였다. 출력의 경우 50 W의 고정 출력이 발생되도록 전원공급장치를 통해 조절하여 실험에 적용하였다(Fig. 1).
Pictorial views of (a) power supply, (b) ultrasonic generator, and (c) circuit board.
2.3. 초음파를 활용한 M. aeruginosa 성장억제 실험
본 연구에서는 1차 초음파 조사 후 초음파의 재조사(re-irradiation)에 따른 M. aeruginosa의 성장억제 효과를 비교 및 분석하기 위하여 대조군 A(0 hr)과 초음파 1차 조사만 적용한 실험군 B(조사시간: 2 hr), 1차 조사 이후 2차 조사를 적용한 실험군 C(추가 조사시간: 0.5 hr), D(추가 조사시간: 1 hr), E(추가 조사시간: 1.5 hr)로 구분하여 각 조건별로 실험을 진행하였다(Table 1). 초음파 조사 조건은 이전 연구(Jang et al. 2022)에서 도출된 최적의 초음파 조사조건(주파수 23 kHz, 출력 6.94 W L-1)을 기반으로 실험을 진행하였으며[25], 초음파 2차 조사의 경우 1차 조사 이후 조류의 재성장이 관측되는 시점(7 day)에 초음파 재조사를 진행하였다.
Experimental conditions for algal growth inhibition by ultrasonic irradiation.
Lee et al. (2018)과 Jang et al. (2022) 등의 선행연구에 따르면 초기 조류 농도가 높을수록 조류 성장억제 효과가 명확하게 관측되는 것으로 보고되고 있다[25,32]. 따라서 본 실험의 초기 농도는 조류경보제 발령 기준 조류대발생 농도(1×106 cells mL-1) 보다 높은 농도(4.5×106 cells mL-1)로 설정하였으며, 7.2 L의 M. aeruginosa 시료를 사용하여 실험을 진행하였다. 모든 실험은 20 cm(L)×20 cm(W)×30 cm(H) 규격의 차광된 아크릴 반응조(acrylic reactor)를 사용하였으며(Fig. 2), Chl-a 및 세포 수 측정을 위해 시료를 충분히 교반 후 상등액을 취수하여 측정을 진행하였다. 또한, 단위 부피당 초음파 조사 에너지(W L-1)의 변화를 방지하기 위하여 채수 후 출력(W)을 조절하여 초음파 조사시간 동안 일정한 단위 부피당 조사 에너지(W L-1)를 유지하였다.
Pictorial view and schematic diagram of ultrasonic reactors used in this study: (a) top view, and (b) cross section side view.
2.4. M. aeruginosa 개체수 분석
초음파 조사에 따른 M. aeruginosa의 성장억제 효과를 관찰하기 위해 혈구계수법(hemocytometry)을 이용하여 M. aeruginosa의 개체수 분석을 진행하였다. 채수한 시료는 루골용액(Lugol’s iodine solution)을 주입하여 고정한 후 암실에 보관하였으며, 시료의 일부를 혈구계수기(Marienfeld, Germany)에 주입하고 광학현미경(DN-10A, Samwon Scientific Industries, Ltd., Korea)을 사용하여 단위 부피당 M. aeruginosa의 개체수(cells mL-1) 분석을 진행하였다.
또한, 초음파 조사에 따른 M. aeruginosa의 개체수 변화를 통해 비성장률(specific growth rate, µ)과 일차분해속도(first order decay rate, k)를 도출하였으며, 다음의 Eq. 1과 Eq. 2를 이용하여 계산하였다.
여기서 µ는 비성장속도상수(hr-1), k는 일차분해속도상수(hr-1), t는 경과시간(hr)을 나타내며 N0는 초기 M. aeruginosa의 개체수(cells mL-1), Nt는 일정시간(t) 경과 후 M. aeruginosa의 개체수(cells mL-1)를 나타낸다.
2.5. 초음파에 의한 M. aeruginosa의 형태학적 변화 분석
초음파 조사에 따른 M. aeruginosa의 세포 표면 및 내부 형질의 변화를 관찰하기 위해 주사전자현미경(SEM)과 투과전자현미경(TEM)을 사용하여 시료를 분석하였다. 0.1 M phosphate buffer (pH 7.2)로 완충시킨 전자현미경 고정액(Karnovsky’s fixative)을 포함한 M. aeruginosa 시료 5mL를 12시간 동안 고정하였으며, SEM 분석을 위해 2시간 동안 poly-L-lysine (Ted pella, USA) 코팅된 10 mm 커버글라스에 부착시켜 0.1 M phosphate buffer로 세정 후 건조하였다. 건조한 시료는 lon coater (EM-ACE600, Leica, USA)를 사용하여 백금(Pt) 코팅 후 10 kV의 가속전압에서 FE-SEM인 MAIA3 (TESCAN, Czech)를 사용하여 M. aeruginosa의 세포 표면을 관찰하였다.
TEM 분석 또한 SEM 분석과 동일한 방법으로 전처리를 진행하였고, 그 후 LR White resin과 100% ethyl alcohol을 2:1, 1:1, 1:2로 혼합한 용액을 6시간 간격으로 치환하여 침투시켰으며, gelatin capsules에 시료와 LR White resin 용액을 주입해 밀봉하여 60℃ 오븐에서 18시간 경화시켰다. 경화된 시료는 관찰할 범위를 설정 후 다이아몬드 나이프(EMS, USA)를 사용하여 70 nm 두께로 절편을 제작 후 5% uranyl acetate와 0.5% lead citrate를 이용해 이중 염색하였다. 염색된 시료는 건조 후 80 kV 가속전압에서 TEM JEM-1010 (JEOL, Japan)을 사용하여 M. aeruginosa의 내부 단면을 관찰하였다.
3. 결과 및 고찰
3.1. 시간에 따른 시료의 육안 변화
초음파 1차 조사 이후 조류의 재성장이 관측 시 초음파를 2차 재조사한 경우, 조류 성장억제에 미치는 영향을 관찰하기 위해 대조군A(0 hr)과 초음파 1차 조사만 적용한 실험군 B(2 hr), 2차 조사를 추가로 적용한 실험군 C(0.5 hr), D(1 hr), E(1.5 hr)의 시료 변화를 총 24일 동안 관찰하였다. 시료의 육안상 변화를 관찰한 결과(Fig. 3), 대조군(A)은 관찰 기간(t ≤ 24 day) 동안 조류 특유의 녹색과 부유성이 지속적으로 증가하는 것을 확인하였으며, 시간이 경과함에 따라 대조군은 조류의 과다성장으로 시료의 색이 짙은 녹색으로 변화하는 것을 관찰하였다(Fig. 3(h)). 초음파 1차 조사만 적용한 실험군(B)은 초음파 조사 종료 후, M. aeruginosa가 부유성을 잃고 바닥으로 가라앉아 초음파 1차 조사 후 5일까지 M. aeruginosa의 침전으로 인한 투명도가 증가하는 것을 관찰하였다(Fig. 3(c)). 이후 초음파 1차 조사만 적용한 실험군(B)에서 재성장이 관찰된 7일에 초음파 2차 조사를 진행하였으며 초음파 2차 조사 종료 4일 후, 실험군(C, D, E)은 M. aeruginosa의 침전으로 인한 녹색 저감과 투명도 증가가 확인되었다(Fig. 3(f)).
Pictorial views of M. aeruginosa in cell culture flask with elapsed time under the different conditions of ultrasonic irradiation [A (control), B (2 hr first irradiation), C (2 hr first irradiation+0.5 hr second irradiation), D (2 hr first irradiation+1 hr second irradiation), E (2 hr first irradiation+1.5 hr second irradiation)].
초음파 2차 조사 종료 17일 경과 후(Fig. 3(h)), 1차 조사만 적용한 실험군(B)은 조류의 급격한 재성장으로 인해 침전된 M. aeruginosa 대비 부유하여 성장하는 M. aeruginosa가 증가된 반면, 2차 조사를 적용한 실험군(C, D, E)은 1차 조사만 적용한 실험군(B) 대비 재성장 시 시료 중 불활성화된(inactivated) M. aeruginosa가 지속적으로 침전되어 있는 것을 관찰하였다. 따라서 시간 경과에 따른 육안상 변화를 관찰한 결과, 초음파 2차 조사를 적용한 실험군(C, D, E)은 초음파 1차 조사만 적용한 실험군(B) 대비 반복적인 조류 성장 불능화(inactivation)로 인하여 조류의 재성장(regrowth)이 지연되는 것을 확인하였으며, 장기적인 조류 성장억제를 위해서는 주기적인 초음파 조사가 필요할 것으로 판단된다.
3.2. Chl-a와 M. aeruginosa의 개체수 변화
시간 경과에 따른 Chl-a와 M. aeruginosa의 개체수 변화를 관찰한 결과(Fig. 4), 대조군(A)은 관찰기간(t ≤ 24 day) 동안 Chl-a 농도와 개체수가 점진적으로 증가하는 것을 관찰하여 조류 성장억제 요인은 없는 것으로 판단된다. 모든 실험군(B, C, D, E)은 초음파 조사 종료 이후 Chl-a 농도 감소와 M. aeruginosa의 개체수 저감이 관찰되었으며, 초음파 1차 조사만 적용한 실험군(B)은 이전 선행연구 Jang et al. (2022), Kang et al. (2022) 등과 유사하게 저감 이후 조류의 급격한 재성장이 진행되어 15일 만에 조류의 개체수가 초기 개체수로 회복된 것을 확인하였다[25,36]. 반면, 초음파 2차 조사를 적용한 실험군(C, D, E)은 1차 조사만 적용한 실험군(B) 대비 초음파의 조사시간을 감소시켜도 조류의 재성장이 지연되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 초음파 재조사를 적용한 M. aeruginosa는 반복적인 초음파 에너지 전달로 인해 기낭 등 조류 세포 내부기관과 세포막에 더 큰 손상이 초래되어 1차 조사 대비 초음파 조사시간을 짧게 하여도 조류의 재성장에 필요한 시간이 증가된 것으로 사료된다.
Changes in (a) Chl-a and (b) cell number of M. aeruginosa with elapsed time under the different conditions of ultrasonic irradiation [A (control), B (2 hr first irradiation), C (2 hr first irradiation+0.5 hr second irradiation), D (2 hr first irradiation+1 hr second irradiation), E (2 hr first irradiation+1.5 hr second irradiation)].
각 실험군의 최대 조류 성장억제 효율을 검토한 결과, 실험군 B 93% 실험군 C 47%, 실험군 D 65% 그리고 실험군 E 71%로 도출되었다. 이는 초음파 1차 조사 시 조류의 초기 개체수(4×106 cells mL-1)가 2차 조사 시 초기 개체수(2×106 cells mL-1) 대비 약 2배 정도 높아 고농도의 시료에서 단위 면적당 초음파에 영향을 받는 세포수가 많아 손상 빈도 또한 높아지기 때문에 조류 저감 효율이 높게 도출된 것으로 판단된다. 이러한 결과를 종합적으로 검토하였을 때, 초음파의 재조사는 반복적인 조류 성장 불능화에 기여하며, 조류의 재성장을 지연시켜 장기적 조류 성장억제에 효과적인 것으로 조사된다. 따라서 정체수역 내 장기적 조류 성장억제를 위해서는 주기적인 초음파 조사가 필요한 것으로 판단되나, 적정 초음파 조사 주기의 경우 실제 현장의 규모, 조류 발생정도, 수온, 광량, 영양염류, 유속 등 다양한 복합적 인자에 따라 상이할 것으로 예상되며, 이러한 초음파 조사 주기의 불확실성을 감소시키기 위해 다양한 조건에서의 추가적인 현장 연구가 필요하다고 판단된다.
3.3. 성장률과 일차분해율 분석
M. aeruginosa 개체수를 통해 비성장속도(µ)와 일차분해속도(k)를 도출한 결과(Fig. 5, Table 2), 관찰기간 동안(t ≦ 24 day) 대조군은 비성장속도가 2.4×10-3 ~ 4.5×10-3 hr-1로 도출되어 지속적인 조류 성장을 확인하였고, 기존 연구에서 도출한 비성장속도(2.1×10-3 ~ 5.9×10-3 hr-1)와 유사한 것으로 확인되어 대조군 내 성장을 저해하는 억제 요인은 없는 것으로 판단된다[25].
Deriviation of first order decay constant (k) and growth rate (μ) of M. aeruginosa between first and second ultrasonic irradiations with different irradiation times.
Summary of progression (μ) and primary decay (κ) of M. aeruginosa under different sonication conditions.
각 실험군은 모두 조류 성장억제 기간 동안 성장률 대비 높은 일차분해속도(kB = 23.0×10-3 hr-1, kC = 21.0×10-3 hr-1, kD = 24.0×10-3 hr-1, kE = 25.0×10-3 hr-1)가 도출되었으며, 이는 선행연구 Jang et al. (2022)에서도 동일하게 초음파를 조사한 실험군에서 성장률 대비 높은 일차분해속도가 확인되었다[25].
초음파 조사에 따른 성장억제 기간 이후, 조류의 재성장(µB = 3.6×10-3 hr-1, µC = 2.8×10-3 hr-1, µD = 2.5×10-3 hr-1, µE = 2.4×10-3 hr-1)이 관측되었으며, 초음파 1차 조사만 적용한 실험군(B) 대비 2차 조사를 적용한 실험군(C, D, E)은 상대적으로 낮은 성장률을 보였다(Fig. 6). 이는 초음파 1차 조사 시 초음파 파장을 피해 수직 이동을 통해 하부로 이동하였거나 충분한 초음파 에너지 전달에 노출되지 않은 일부 조류 세포들이 일정 기간 이후 다시 부유하여 빠르게 성장한 반면, 초음파 2차 조사를 적용한 실험군은 초기 조사시간 대비 조사시간을 단축하여도 반복적인 초음파 에너지 전달로 인해 조류 성장 불능화가 가속되어 조류의 재성장에 필요한 시간이 증가된 것으로 사료된다. 이와 같이 M. aeruginosa의 개체수 변화를 통해 도출된 성장률과 일차분해속도의 변화를 근거로 초음파 기술의 현장적용 시, 조류의 장기적인 저감을 위해서는 주기적인 초음파 조사가 필요하다고 판단된다. 또한, 일반적으로 초음파의 조사시간은 운영비용에 비례하기 때문에 초음파 재조사 시 초기 조사시간 대비 조사시간의 단축을 통해 운영비용의 절감 및 효과적이고 장기적인 조류 제어가 가능할 것으로 판단된다.
Comparison of first order decay constant (k) and growth rate (μ) of M. aeruginosa between first and second ultrasonic irradiations with different irradiation times.
3.3. 초음파에 의한 M. aeruginosa의 형태학적 변화
초음파 조사 조건에 따른 M. aeruginosa의 형태학적 변화를 관찰하기 위해 SEM과 TEM을 이용하여 세포 표면 및 내부 형질 변화를 비교 분석하였다. SEM 분석 결과(Fig. 7), 대조군(A)은 매끄러운 세포 표면 형태를 유지하며, 세포 표면의 손상이 관측되지 않았다. 반면, 모든 실험군(B, C, D, E)은 기존 선행 연구 결과와 동일하게 초음파의 영향으로 인해 명확한 세포막 손상이 관찰되었으며, 초음파 1차 조사(실험군 B) 대비 2차 조사를 적용한 실험군(C, D, E)에서 조류 세포의 손상이 더욱 뚜렷하게 관측되었다. 이러한 초음파 공동현상에 따른 조류 세포막의 손상은 조류 세포 주변 환경과의 상호작용을 저해하여 세포의 전해질 및 삼투압 조절이 불가하며, ATP 생성 및 산화적 인산화에 관련된 에너지 대사가 교란되어 성장억제로 이어지는 것으로 판단된다.
Scanning electron microscopic images of M. aeruginosa with different experimental conditions.
TEM 분석 결과(Fig. 8), 대조군(A)은 M. aeruginosa의 세포 내부 기관 및 기낭의 손상이 관측되지 않았으나, 초음파 2차 조사를 적용한 실험군(C, D, E)은 초음파의 영향으로 인하여 M. aeruginosa의 기낭 파괴 및 기낭의 분포 감소 및 이상이 확인되었다. 이와 동일하게 선행연구 Srisuksomwong et al. (2012), Kong et al. (2019), Park et al. (2019), Kang et al. (2022)에서도 초음파 조사로 인한 조류의 기낭 파괴 및 세포 손상을 관찰하여 보고한 바가 있으며[24,36-38], 이러한 초음파에 의한 조류 세포 내 기낭의 감소는 조류의 부력조절 능력을 상실시키고, 조류를 침전시키며 세포막의 기능장애를 통해 세포 내부 환경의 급격한 변화를 일으켜 광합성 작용을 차단함으로써 조류의 성장억제를 초래한다. 또한, 실험군의 경우 초음파 조사로 인해 기낭 손상으로 인한 가스 방출로 세포막과 세포질 사이 가스 공간(gas gap)이 형성되어 세포가 확장(swelling)되어 있는 상태이다[39]. 이로 인해 물질 전달 저해 및 산소결핍에 의해 미토콘드리아에서 ATP의 생산이 중단되어 세포 내부 환경이 유지되지 못해 성장이 저해된 것으로 판단된다. 이러한 세포 확장현상은 조사시간과 비례하여 증대되었으며, 세포막의 기능장애가 더욱 심화된 것을 명확하게 관찰할 수 있었다.
Transmission electron microscopic images of M. aeruginosa. (note that dotted line indicates cell surface damages in M. aeruginosa; arrows indicate the space where gas gap occurred; FS indicates food storage particles; CW indicates cell wall; and, GV.C indicates gas vesicle in cross-section view).
4. 결 론
본 연구에서는 초음파 1차 조사 후 조류의 재성장 시 초음파의 재조사(re-irradiation)를 통하여 M. aeruginosa의 성장억제 효과를 조사하고 조류 성장억제 효율과 효과의 지속성을 확인하기 위하여 실험실 규모 실험을 진행하였으며 다양한 분석을 통해 다음과 같은 결론을 도출하였다.
1) Chl-a와 M. aeruginosa 개체수 분석 결과, 모든 실험군(B, C, D, E)은 초음파 조사 종료 이후 대조군 대비 Chl-a 농도 감소와 M. aeruginosa의 개체수 저감이 관찰되었으며, 초음파 1차 조사만 적용한 실험군(B)은 저감 이후 조류의 급격한 재 성장이 진행된 반면, 초음파 2차 조사를 적용한 실험군(C, D, E)은 1차 조사만 적용한 실험군(B) 대비 초음파의 조사시간이 줄어들어도 조류의 재성장이 지연되는 것을 확인하였다.
2) 비성장속도(µ)와 일차분해속도(k)를 도출한 결과, 실험군 (B, C, D, E)은 조류 성장억제 기간 동안 성장률 대비 높은 일차분해속도가 도출되었으며, 모든 실험군에서 조류의 재성장이 관측되었다. 재성장 기간 동안 초음파 2차 조사를 적용한 실험군(C, D, E)은 반복적인 조류 성장 불능화로 인하여 초음파 1차 조사만 적용한 실험군(B) 대비 성장률이 상대적으로 낮은 것을 확인하였다. 따라서 초음파 재조사 시 초기 조사 시간 대비 조사시간의 단축을 통해 운영비용의 절감 및 효과적이고 장기적인 조류 제어가 가능할 것으로 판단된다.
3) SEM, TEM 분석 결과, 모든 실험군(B, C, D, E)은 초음파의 영향으로 인하여 명확한 조류 세포 표면 및 세포막 손상이 관측되었고, 초음파 1차 조사 대비 2차 조사를 적용한 실험군(C, D, E)은 조류 세포의 손상이 더욱 뚜렷하게 관측되었다. 또한, 모든 실험군은 대조군 대비 초음파의 영향으로 M. aeruginosa 세포 내 기낭이 파괴되어 분포가 감소된 것을 관찰하였으며, 일부 세포확장현장이 관측되었다. 이러한 형태학적 변화는 조사시간과 비례하여 증대되는 것을 확인하였다.
4) 종합적으로 검토하였을 때, 초음파에 의한 조류 성장억제 효과를 확인하였으며, 초음파의 재조사는 반복적인 에너지 전달로 인하여 기낭 등 조류 세포 내부기관과 세포막의 손상을 심화시키며, 조류 성장 불능화가 가속화되어 1차 조사 대비 초음파 조사시간을 단축하여도 조류의 재성장에 필요한 시간은 더욱 증가되는 것을 확인하였다. 따라서, 정체수역 내 장기적 조류 성장억제를 위해서는 주기적인 초음파 조사가 필요하나, 재조사 간격은 실제 현장의 규모, 조류 발생 정도, 수온, 광량, 영양염류, 유속 등 다양한 복합적 인자의 영향에 따라 상이할 것으로 예상되며, 최적화된 초음파 조사 프로토콜을 수립하기 위해서는 다양한 조건에서의 부지특이성을 고려한 현장 연구가 필요할 것으로 판단된다.
Notes
Declaration of Competing Interest
The authors declare that they have no known competing financial interests or personal relationships that could have appeared to influence the work reported in this paper.